張世民，董洪梅，趙瑞君

(1. 彭澤縣人民醫(yī)院普外科，江西彭澤 332700；2. 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院腫瘤精準醫(yī)學(xué)和病理研究所，廣東廣州 510632；3. 南昌市第三醫(yī)院乳腺疾病診療中心，江西南昌 330009)

最新全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌仍然高居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位，其每年新增病例226萬例，死亡人數(shù)68萬，其中雌激素受體(ER)陽性乳腺癌約占全部乳腺癌的70%[1]。目前，針對ER陽性乳腺癌的主要治療策略是內(nèi)分泌治療，這種治療方式已經(jīng)在一定程度上延長了乳腺癌患者的生存時間，但仍有一些患者在接受治療的過程中產(chǎn)生耐藥，從而影響后續(xù)的治療[2-3]。發(fā)生耐藥的患者，其癌細胞侵襲性更強，更容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良[3]。因此，尋找與ER陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的分子標志物，對ER陽性乳腺癌的診斷、治療具有十分重要的指導(dǎo)意義。

GAB1蛋白(Grb2-associated binding protein 1)是一類能與生長因子受體結(jié)合蛋白2(GAB2)相結(jié)合的適配蛋白。GAB1蛋白在哺乳動物的細胞質(zhì)中廣泛表達，激活后能參與不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是可以通過激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)及磷酸肌苷3-激酶(PI3K/Akt)信號通路，進而促進細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移[4]。目前，已有多項研究表明，GAB1與肝癌、膠質(zhì)瘤、非小細胞肺癌和口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤密切相關(guān)[5]，但GAB1在ER陽性乳腺癌中的表達、預(yù)后以及對腫瘤細胞的侵襲、遷移過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化意義卻未見報道。本研究通過免疫組化方法分析GAB1在乳腺癌組織中的表達情況，通過Transwell實驗檢測干擾GAB1基因后對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響， Western blotting法檢測干擾GAB1后EMT因子的表達，多因素COX比例風險模型分析GAB1與ER陽性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，旨在揭示GAB1在ER陽性乳腺癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，為ER陽性乳腺癌患者的治療和預(yù)后提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集南昌市第三醫(yī)院2003年7月至2012年1月間收治的資料完整的171例ER陽性乳腺癌。所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)前均未行新輔助化療、放療或內(nèi)分泌治療。所有患者均為女性，年齡25～76歲，中位年齡50歲。腫瘤直徑≤2 cm的患者103例，>2 cm的患者68例；有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者56例，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者115例；腫瘤組織學(xué)分級為Ⅰ級的患者57例，Ⅱ級的患者72例，Ⅲ級的患者42例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)乳腺癌分期第6版分期標準，Ⅰ期和Ⅱ期的患者105例，Ⅲ期的患者66例?；颊咧形浑S訪時間為99個月(6～148個月)。本研究所有患者都簽署了知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測免疫組織化學(xué)染色采用SP二步法。兔抗人GAB1多克隆抗體購自Abcam公司，SP試劑盒購自福州邁新公司。將手術(shù)切除的乳腺腫瘤組織，經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，PBS沖洗，30 mL/L H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，血清封閉，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組化的結(jié)果判定由兩名病理學(xué)專家在臨床和病理資料雙盲條件下對免疫組化的染色結(jié)果進行評分。GAB1蛋白細胞質(zhì)染色為陽性染色。毎例組織選取10個高倍鏡(×400)視野，按照陽性腫瘤細胞占總細胞的百分比及細胞染色強度進行評判：①按陽性細胞百分比進行評分：無陽性染色細胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。②按細胞染色強度進行評分：弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。將兩者得分相乘得到總分數(shù)：即0～12分。根據(jù)約登指數(shù)最大原則將評分≥4的患者定義為GAB1高表達組，評分<4定義為GAB1低表達組。

1.4 細胞培養(yǎng)ER陽性的乳腺癌細胞MCF-7購自ATCC細胞庫。常規(guī)培養(yǎng)于含100 mL/L FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期的MCF-7細胞接種于6孔板，當細胞融合率達70%～80%時可以進行轉(zhuǎn)染。取MCF-7/shGAB1, MCF-7/shRNA-control質(zhì)粒，分別與新鮮無血清DMEM培養(yǎng)液混合。室溫靜置20 min，將混合液滴加至相應(yīng)孔中，放于50 mL/L CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，PBS漂洗，消化細胞，加400 μg/mL G418(美國Gibco公司)篩選細胞，10 d左右后形成陽性抗性克隆，經(jīng)蛋白水平鑒定，確認獲得穩(wěn)定干擾GAB1基因的細胞。

1.6 Western blotting檢測GAB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達提取MCF-7細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g/L奶粉封閉液室溫封閉1 h，分別使用anti-GAB1(1∶1 000)、anti-E-cadherin(1∶1 000)和anti-Vimentin(1∶2 000)抗體4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h，TBST液洗膜3次，每次洗10 min，ECL發(fā)光試劑盒顯影曝光。

1.7 干擾GAB1對MCF-7細胞遷移和侵襲能力的影響將MCF-7-shGAB1，MCF-7/shRNA-control細胞按1×105/孔的細胞密度接種到人工基底膜上。侵襲實驗中，碳酸酯膜(PVPF膜，孔徑8 μm)上包被1 mg/mL的Matrigel膠，37 ℃放置30 min。下室加入500 μL含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，在上室中分別加入上述2組含無血清培養(yǎng)基的單細胞懸液，37 ℃孵育24 h后，1 mL甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染液染色5 min，用乙醇棉球小心擦掉上室沒侵襲到下室的細胞。正置顯微鏡下選取5個200×視野，計算平均值，比較細胞相對侵襲和遷移能力。細胞遷移實驗除上層小室不加Matrigel基質(zhì)膠外，培養(yǎng)、染色、計數(shù)方法同侵襲實驗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2組樣本均數(shù)的比較采用Student’st檢驗。使用χ2檢驗分析GAB1蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。采用Kaplan-Meier曲線法進行無復(fù)發(fā)生存分析，顯著性比較采用Log-rank檢驗，使用單因素和多因素Cox比例風險模型分析GAB1和臨床參數(shù)對患者預(yù)后的影響。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GAB1在ER陽性乳腺癌組織中的表達免疫組化結(jié)果顯示，在171例ER陽性乳腺癌組織中，93例(54.4%)為GAB1高表達，78例(45.6%)為GAB1低表達。GAB1主要陽性表達部位為腫瘤細胞的細胞質(zhì)(圖1)。

圖1 GAB1在ER陽性乳腺癌組織中的表達情況

2.2 GAB1表達與ER陽性乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系通過χ2檢驗分析GAB1蛋白表達與ER陽性乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的GAB1高表達率明顯高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者(P=0.014)；腫瘤分期為Ⅲ期組的GAB1高表達率明顯高于腫瘤分期為Ⅰ+Ⅱ期組患者(P=0.011)，GAB1表達與患者年齡、腫瘤直徑和腫瘤的組織學(xué)分級無關(guān)(表1)。

表1 GAB1表達與ER陽性乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 穩(wěn)定干擾GAB1基因細胞系的成功構(gòu)建Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，干擾GAB1的MCF-7細胞組中GAB1的蛋白表達明顯降低，證明本研究成功建立了穩(wěn)定干擾GAB1基因的細胞系(圖2)。

圖2 Western blotting檢測干擾GAB1及對照組細胞中GAB1蛋白的表達

2.4 干擾GAB1對MCF-7細胞的遷移侵襲能力的影響通過Transwell侵襲遷移實驗評估GAB1對MCF-7細胞侵襲遷移能力的影響。細胞遷移實驗顯示，與對照組相比，遷移到下室的shGAB1組細胞數(shù)目明顯減少(P<0.001，圖3)。侵襲實驗結(jié)果也顯示，與對照組相比，侵襲到下室的shGAB1組細胞數(shù)目也明顯減少(P=0.002，圖3)。

圖3 干擾GAB1對MCF-7細胞遷移侵襲能力的影響

2.5 干擾GAB1對EMT相關(guān)因子的影響與對照組比較，干擾GAB1表達后，E-cadherin的表達水平明顯增高，而Vimentin的表達明顯降低(圖4)。

圖4 Western blotting檢測干擾GAB1后E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

2.6 GAB1表達與ER陽性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系使用Kaplan-Meier方法評估GAB1表達對ER陽性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存的影響。結(jié)果表明，與GAB1低表達組相比，GAB1高表達組患者的無復(fù)發(fā)生存率更短(P=0.002，log-rank檢驗，χ2=9.649)(圖5)。GAB1高表達組患者的平均無復(fù)發(fā)生存時間為96.6個月，而GAB1低表達組患者的平均無復(fù)發(fā)生存時間為119.5個月。

圖5 GAB1高表達與ER陽性乳腺癌患者預(yù)后不良的相關(guān)性

2.7 GAB1表達與ER陽性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存的單因素及多因素分析使用Cox比例風險模型對乳腺癌患者的年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、分期以及GAB1表達情況分別進行單因素分析。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期以及GAB1表達與患者無復(fù)發(fā)生存密切相關(guān)。對以上所有因素再進行多因素分析，結(jié)果顯示，分期(P=0.024，HR=1.888，95%CI=1.086～3.284)和GAB1表達(P=0.010，HR=1.932, 95%CI=1.170～3.189)是影響患者無復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)后因素(表2)。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其病因尚未完全清楚，一旦進入晚期，就容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在中國，2020年新增乳腺癌病例42萬例，死亡人數(shù)約為12萬[1]。三苯氧胺作為ER陽性乳腺癌患者的主要治療藥物，明顯提高了患者的生存率，然而，30%的患者在接受三苯氧胺治療過程中出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致在5年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。

GAB1基因定位于人染色體4q31.1，其蛋白由694個氨基酸殘基組成，能被多種受體或非受體酪氨酸激酶激活，受生長因子、細胞因子、抗原和其他分子的刺激而發(fā)揮多種促癌功能[7]。GAB1蛋白通過參與多種原癌基因表達，從而參與調(diào)控與腫瘤相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。GILLGRASS等[9]在ErbB2誘導(dǎo)的乳腺腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR依賴的GAB1蛋白的激活能促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。ORTIZ-PADILLA等[10]在一項乳腺癌基因突變篩查中發(fā)現(xiàn)，GAB1的兩個體細胞發(fā)生突變(Y83C和T387N)，通過對這兩個突變體功能的研究發(fā)現(xiàn)，GAB1信號的異常表達可直接促進乳腺癌的進展。

本研究發(fā)現(xiàn)，GAB1在ER陽性乳腺癌組織中高表達，且GAB1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，干擾GAB1可明顯抑制ER陽性乳腺癌細胞系MCF-7細胞的侵襲和遷移能力。EMT是指上皮細胞到間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化，在細胞侵襲遷移、細胞外基質(zhì)改變和細胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，其中以上皮標志物E-cadherin的減少或缺失和間質(zhì)蛋白標記物vimentin蛋白表達上調(diào)為主要特征[11]。為了進一步研究GAB1與轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究通過Western blotting法檢測GAB1對EMT相關(guān)因子E-cadherin及Vimentin表達的影響發(fā)現(xiàn)，干擾GAB1表達后，E-cadherin的表達明顯增高，而Vimentin的表達明顯降低。以上結(jié)果提示了GAB1高表達和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

HU等[12]通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，突變體Shp2顯著促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，至少是部分通過激活GAB1-RAS-ERK信號軸來實現(xiàn)的，這一發(fā)現(xiàn)對于乳腺癌的治療有重要意義。CHEN等[13]通過高通量篩選500個化合物得到5個靶點，這些靶點與GAB1PH結(jié)構(gòu)域具有很強的結(jié)合親和性，能夠抑制GAB1的磷酸化，并對MDA-MB-231和T47D乳腺癌細胞系發(fā)揮腫瘤特異性細胞毒性作用；該研究發(fā)現(xiàn)了針對GAB1PH結(jié)構(gòu)域抑制劑的新藥，具有乳腺癌靶向治療的潛力，對指導(dǎo)未來基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計提供了新的思路。本研究通過單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，GAB1高表達組患者的無復(fù)發(fā)生存率更短，且GAB1是影響患者無復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)后因素。這提示GAB1高表達與ER陽性乳腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，GAB1在ER陽性乳腺癌中高度表達，與乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是評估ER陽性乳腺癌患者預(yù)后的潛在靶點，也為ER陽性乳腺癌的治療提供新的依據(jù)。后續(xù)我們將通過體內(nèi)試驗對GAB1表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制進行進一步探討，為深入挖掘促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制提供新的證據(jù)。