何洋， 王黎洲， 李成， 安天志， 周石， 段慶紅*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 介入科， 貴州 貴陽 550004)

在我國腦血管疾病的患者越來越多，已成為心臟病之后的第2大死因[1]。我國每年腦血管疾病新發(fā)患者約270萬，約130萬患者死于腦血管疾病[2]。卒中為常見的腦血管疾病，其中缺血性卒中所占比例高達(dá)85%[3]，目前腦缺血再灌注損傷是引發(fā)缺血性腦卒中致殘及致死的重要原因，患者后遺癥往往比較嚴(yán)重[4-5]，但其涉及的相關(guān)通路及干預(yù)靶點仍不十分明確。腦缺血再灌注損傷受多條信號通路的影響，目前相關(guān)報道主要為Toll樣受體、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶及Notch信號通路等[6]，其中重組信號序列結(jié)合蛋白J(recombination signal sequence binding protein J，RBPJ)為Notch信號通路的關(guān)鍵蛋白，不僅與腦梗死的程度密切相關(guān)，同時與腦缺血再灌注后神經(jīng)功能的修復(fù)密切相關(guān)，而腦缺血再灌注損傷患者血清中的微小核糖核酸(microRNA，miR)含量往往發(fā)生變化[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR155可通過Notch信號通路調(diào)節(jié)一氧化氮(nitric oxide，NO)和內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)[8]；腦缺血再灌注后會導(dǎo)致炎癥因子含量明顯升高，引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)一系列的并發(fā)癥[9]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是1992年首次發(fā)現(xiàn)的一種能與促紅細(xì)胞生成素基因相結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子[10]。有報道發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注時，HIF-1α含量會迅速升高，引起炎癥反應(yīng)[11]；miR155通過影響HIF-1α促進(jìn)血管損傷再生[8]。本研究擬通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，探討RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應(yīng)分子之間的關(guān)聯(lián)性，并通過基因過表達(dá)和沉默技術(shù)進(jìn)一步驗證通路效應(yīng)分子相關(guān)作用位點及其與炎癥因子的作用，進(jìn)而為腦缺血再灌注損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性8周齡健康Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～300 g，飼養(yǎng)于無菌、恒溫及暗明交替的清潔級環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，避免外界刺激，術(shù)前12 h禁食；新生24 h以內(nèi)的雄性SD乳鼠10只，體質(zhì)量6～8 g。實驗動物均由學(xué)校動物實驗中心提供，本研究獲得學(xué)校動物倫理委員會批準(zhǔn)(1800823)。

1.1.2主要試劑和儀器 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)染色液(天津灝洋)，免疫組織化學(xué)和TRIzol試劑盒(美國Miltenyi Biotec)，75%乙醇和三氯甲烷(天津大茂)，Neurobasal-A培養(yǎng)基、B-27及GlutaMAX添加劑(美國Life Technologies)，無菌乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic，EDT)抗凝采血管和96孔培養(yǎng)板(美國BD)，磷酸鹽緩沖液(美國SAB)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(中國碧云天)，HIF-1α酶聯(lián)免疫試劑盒(上海BG)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)及IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國R&D Systems)。

1.2 方法

1.2.1大鼠腦缺血再灌注模型的建立及分組 60只雄性大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)化均分為假手術(shù)(sham)組和實驗組。實驗組大鼠采用10%水合氯醛300 mg/kg劑量腹腔注射，運用頸內(nèi)動脈線栓法建立大鼠腦缺血模型[12]，即暴露大鼠頸外動脈(external carotid arteries，ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)及左頸總動脈后，微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA；在距 CCA 分叉部 4mm 處剪一小口，將拴線插入到 ICA，用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當(dāng)插入深度約18 mm 時停止推送，此時線栓頭端至大腦中動脈內(nèi)并阻斷其相應(yīng)區(qū)域的血液供應(yīng)，并即刻開始計時，90 min后從ICA中輕輕取出線栓進(jìn)行再灌注[8]。Sham組大鼠麻醉后接受和實驗組進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但不置入線栓(即無大腦中動脈血流阻斷)，手術(shù)全程及結(jié)束后均于37 ℃恒溫電熱板上維持大鼠體溫。術(shù)后采用Longa評分評估神經(jīng)功能損傷[13]。后0.3 mL/100 g水合氯醛腹腔麻醉2組大鼠后斷頭取腦。

1.2.2TTC染色及梗死體積測量 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，-20 ℃冰箱速凍15 min，作2 mm厚度的連續(xù)切片。將切片置于2%TTC避光，37 ℃溫箱20 min，均勻染色，4%多聚甲醛固定，染成紅色的為正常腦組織，白色為梗死腦組織，將染色的腦片按切片順序排列，標(biāo)號、設(shè)定標(biāo)尺并拍照(圖1)，取梗死灶相對最大的切片，計算梗死灶所在層面的面積百分比。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 檢測腦組織miR-155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達(dá) 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，提取RNA，加離子水50 μL溶解RNA，15 ℃水浴10 min，使用紫外分光光度計測定提取RNA的純度，儲存于-80 ℃冰箱中。進(jìn)一步將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后采用qRT-PCR檢測miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達(dá)。RTQ-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)反應(yīng)2 min，95 ℃變性，擴(kuò)增40個循環(huán)，60 ℃退火、延伸。miR155(正向5′-GCTTCGGTAATGCTAATCGTG-3′，反向5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA3′,)；Notchl (正向5′-TCAATGTTCGAGGACCAGATG-3′，反向5′-TCACTGTFGCCTGTCTCAAG-3′)；Hesl (正向5′-AGCCAACTGAAAACACCTGATY-3′，反向5′-GGACTrrATGATTAGCAGTGG-3′)；GAPDH(正向5′-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，反向5′-ACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′)，比較循環(huán)閾值(Ct)法計算基因相對表達(dá)量。

1.2.4ELISA檢測腦組織中HIF-1α、TNF-α、IL-1β及IL-6 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，1 200 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA法檢測腦組織中HIF-1α水平，嚴(yán)格按照檢測試劑說明書操作。實驗組和sham組大鼠及轉(zhuǎn)染慢病毒抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后實驗組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平同樣采用ELISA法檢進(jìn)行，所有操作均按照試劑盒完成。

1.2.5組織病理染色顯微鏡鏡下觀察腦組織學(xué) 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，固定于10%福爾馬林溶液中，后行石蠟包埋、切片、抗原修復(fù)等，再血清封閉，最后行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色；或行免疫組織化學(xué) (immunohistochemistry, IHC)染色，檢測對應(yīng)加NF-κB一抗，加生物素標(biāo)記二抗，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，顯微鏡鏡下觀察染色。

1.2.6蛋白印跡法(Western blot)檢測HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達(dá) 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，RIPA裂解，轉(zhuǎn)移至4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min，取上清液，保存至-80 ℃冰箱，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS- PAGE)分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜 (polyvinylidene fluoride，PVDF)上，加相應(yīng)抗體后4 ℃ PBST沖洗3次，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)結(jié)合二次抗體孵育30 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒處理PVDF膜，使用QualityOne 軟件進(jìn)行分析。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測及染色質(zhì)免疫共沉淀測序檢測miR155與HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互作用位點 使用Promega 的雙熒光素酶基因報告分析系統(tǒng)進(jìn)行樣品熒光素酶活性的測定，將HIF-1α基因相關(guān)結(jié)合位點the hypoxia-responsive element (HRE)及E-box: CANNTG至pSICHECK-2雙熒光素報告載體中，使用miR155片段分別與HRE質(zhì)粒載體及CANNTG載體共同轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)細(xì)胞，使用雙熒光素試劑盒檢測HRE及E-box:CANNTG的調(diào)控；分別將RBPJ、NF-κB基因相關(guān)序列3′UTR及突變位點克隆至pSICHECK-2雙熒光素報告載體中，使用miR155片段分別與3′UTR質(zhì)粒載體及突變載體共同轉(zhuǎn)染VEC細(xì)胞，使用雙熒光素試劑盒分別檢測RBPJ、NF-κB基因相關(guān)序列3′UTR及突變序列的調(diào)控作用；采用染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-Seq)進(jìn)行大鼠腦組織細(xì)胞的裂解，使用提取總脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)，使用抗體進(jìn)行免疫沉淀，通過洗滌、解交聯(lián)等得到純化的ChIP-DNA片段。

1.2.8神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 取SD乳鼠麻醉狀態(tài)下處死，整只浸泡于75%乙醇中約5 min，無菌取頭、取大腦，取出的雙側(cè)大腦海馬置于預(yù)冷的D-Hank＇s平衡鹽溶液中；將海馬組織剪成1 mm3大小的組織塊，0.25%胰蛋白酶消化15 min，置特殊培養(yǎng)基(谷氨酰胺500 μL、雙抗500 μL、B27 1 mL及neurobasal-A 48 mL)于37 ℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)[14]，最終獲取原代神經(jīng)元細(xì)胞以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.9慢病毒轉(zhuǎn)染 乳鼠神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長覆蓋度達(dá)50%時進(jìn)行慢病毒感染，對照組加10 μL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染組分別加miR155-shRNA 10 μL +Polybrene 2 μL、HIF-1α-shRNA 10 μL+Polybrene 2 μL、RBPJ- shRNA 10 μL+Polybrene 2 μL、NF-κB- shRNA 10 μL+Polybrene 2 μL干擾病毒，轉(zhuǎn)染過夜，每日更換培養(yǎng)基，5 d后使用Western blot鑒定進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染效果檢查，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。 收集對照組和轉(zhuǎn)染組上清液，采用ELISA法檢測RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α中沉默其中1個分子后其它3個分子的表達(dá)水平；實驗操作流程具體按照檢測試劑說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注損傷大鼠模型

sham組大鼠Longa評分為(0.00±0.00)分，實驗組為(2.59±0.39)分，實驗組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.92，P<0. 001)；經(jīng)TTC染色后，梗死區(qū)域為白色，非梗死區(qū)域為紅色，實驗組大鼠腦梗死面積明顯大于sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為TTC染色(白色為梗死區(qū)域，紅色為非梗死區(qū)域),B為梗死面積百分比；(1)與sham組比較，P<0. 05。

2.2 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應(yīng)分子的含量

HE染色結(jié)果表明，sham組大鼠大腦皮層組織完整、神經(jīng)元完整、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰且NF-κB存在于細(xì)胞漿、內(nèi)無明顯移位，實驗組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少、NF-κB明顯從細(xì)胞漿移位于細(xì)胞核；免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠腦組織中miR-155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達(dá)水平均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05)。見圖2和圖3。

圖2 sham組和實驗組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞和NF-κB的表達(dá)(400×)

注：A為條帶灰度圖；B為qRT-PCR定量結(jié)果；(1)與sham組比較，P<0. 05。

2.3 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路軸效應(yīng)分子的關(guān)系

使用基因沉默技術(shù)，分別沉默miR155、HIF-1α、RBPJ、NF-κB其中的一種對RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應(yīng)分子的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行驗證，結(jié)果表明沉默RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路中單個效應(yīng)分子，剩余的3個效應(yīng)分子的表達(dá)均較sham組升高(P<0. 05)。見表1。

表1 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應(yīng)分子的關(guān)系

2.4 miR155與HIF-1α、RBPJ及NF-κβ的相互作用位點

利用雙熒光素酶報告基因檢測、ChIP-Seq檢測miR155與HIF-1α、RBPJ及NF-κB相互作用位點，對miR155與HIF-1α的結(jié)合情況進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間的結(jié)合位點為E-box: CANNTG，雙熒光素酶報告提示miR-155與E-box:CANNTG進(jìn)行結(jié)合；對miR-155與NF-κB的結(jié)合情況進(jìn)行研究分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間的結(jié)合位點為AC-CAAAG，雙熒光素酶報告提示miR-155與NF-κB3′UTR進(jìn)行結(jié)合；對miR-155與RBJP的結(jié)合情況進(jìn)行研究分析，雙熒光素酶報告提示miR-155與RBJP3′UTR進(jìn)行結(jié)合。見圖4。

注：黑色標(biāo)注圈為ACTA1的3′UTR種子區(qū)。

2.5 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路與炎癥因子的聯(lián)系

ELISA法檢測結(jié)果顯示，實驗組大鼠阻斷前血清炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)均較sham組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05)；通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)較實驗組轉(zhuǎn)染前均下降(P<0. 05)。見表2。

表2 sham組和實驗組大鼠血清炎癥因子水平

3 討論

缺血性腦卒中的治療已取得了很大進(jìn)展，但仍有許多問題需要解決。溶栓時間窗的擴(kuò)展和溶栓藥物的選擇均是亟待解決的問題[15-16]。臨床上常用的溶栓藥物如纖溶酶等，雖然可恢復(fù)缺血半暗帶的血流供應(yīng)，挽救缺血組織，然而治療方式受時間影響較大，有效時間窗較短；且在恢復(fù)供血的過程中，可能會造成腦缺血再灌注損傷[17]。腦缺血再灌注的過程中，受損腦組織由于血流量的減少，存在缺氧問題，炎癥反應(yīng)在缺氧狀態(tài)下不斷增強(qiáng)，炎癥介質(zhì)快速增多，介導(dǎo)不同的信號通路[18]。本研究在動物水平通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，通過熒光定量PCR及免疫組化等方法對RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應(yīng)分子之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行合理推測，并通過基因過表達(dá)、沉默技術(shù)進(jìn)一步驗證該通路miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB效應(yīng)分子之間是互相連通的，也進(jìn)一步驗證RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路的存在。

腦缺血再灌注模型中腦損傷機(jī)制較為復(fù)雜，受多種細(xì)胞通路、多種調(diào)控分子的作用，在病情的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[19]。已有研究證實miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB等與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，對腦組織的損傷呈上升趨勢，且能激活炎癥相關(guān)因子來促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生及發(fā)展[20-21]，但各通路相關(guān)蛋白間是否存在相互作用，以及各通路相關(guān)蛋白間是否相互作用尚不明確。本研究結(jié)果表明，RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路相關(guān)蛋白miR155、HIF-1α、RBPJ、NF-κB在腦缺血損傷再灌注模型大鼠中的表達(dá)均高于sham組，提示該通路與大鼠腦缺血損傷再灌注損傷密切相關(guān)，與既往的文獻(xiàn)報道一致[22]。

雙熒光素酶報告基因技術(shù)和ChIP-Seq為近年來新興的生物測定技術(shù)是在染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)及基因測序技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的綜合性檢驗技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)獲得與DNA結(jié)合蛋白相互作用的DNA片段信息，是與深度基因相結(jié)合的方法，據(jù)報道兩種檢測方法具有一定的可行性[23]，故本次研究的方法是準(zhǔn)確合理的。本研究主要使用上述方法進(jìn)行了通路中miR155與其他信號分子間相互作用位點的測定，證實了miR155與HIF-1α、RBPJ以及NF-κB均存在相互作用的結(jié)合位點。

腦缺血再灌注時，在缺血灶局部存在大量炎癥因子，并且炎癥細(xì)胞的激活、浸潤及黏附分子的合成分泌呈一種相互增強(qiáng)相互促進(jìn)的級聯(lián)反應(yīng)，并通過一定的炎癥信號通路使腦組織由缺血性損傷轉(zhuǎn)向炎癥性損傷[24]。本次研究表明RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),通路的相關(guān)蛋白miR155與HIF-1α、RBPJ以及NF-κB相互影響，共同作用，通過阻斷上述通路能夠降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，說明腦缺血再灌注損傷模型中炎癥因子表達(dá)增多與RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路激活密切相關(guān)，將來可通過改善RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α信號通路的響應(yīng)，會在一定程度上減輕腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路在大鼠腦缺血再灌注損傷中起著重要的調(diào)控作用，機(jī)制可能與該通路相關(guān)蛋白miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB之間相互影響，并和炎癥因子的表達(dá)相關(guān)。