譚大為， 蘇艷麗， 鄭丹， 鄭方， 童曉麗

(1.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院 血液內(nèi)科， 貴州 貴陽 550014； 2.貴陽護理職業(yè)學院 醫(yī)學技術(shù)系， 貴州 貴陽 550081)

伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma，BL)是具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤，常發(fā)生在淋巴結(jié)外的部位,骨髓累及超過25%，其惡性程度極高，細胞倍增周期極短，生長非常迅速，若治療不及時，患者在數(shù)月內(nèi)死亡[1]。BL發(fā)病機制已證實部分與EB病毒(EB virus，EBV)感染相關(guān)[2-3]，且在臨床上觀察到，EBV陽性(EBV+)淋巴瘤病例相較于EBV陰性(EBV-)淋巴瘤病例，預后明顯較差[4-6]；研究發(fā)現(xiàn)針對EBV+淋巴瘤誘導EBV進入裂解期的抗病毒治療，有可能更好地徹底殺滅腫瘤細胞[7-8]。Raji細胞作為BL細胞株，是第1個人類造血系統(tǒng)的連續(xù)傳代細胞，是淋巴母細胞樣、B細胞起源及EBV+的細胞株[9]。干擾素具有抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖及免疫調(diào)節(jié)作用，廣泛用于病毒性疾病和惡性腫瘤等疾病的治療[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干擾素能夠有效地抑制Raji細胞增殖，并能夠上調(diào)EB病毒限制性內(nèi)切酶Ⅰ Z左片段1(EBV BamH Ⅰ Z left fragment 1，BZLF1)和EB病毒限制性內(nèi)切酶I R左片段1(EBV BamH I R left fragment 1，BRLF1)mRNA的表達[13]，但目前臨床應(yīng)用干擾素治療淋巴瘤仍然未達成共識。達沙替尼為替尼類Abelson(ABL)和Sarcoma(SRC)激酶雙重抑制劑，主要用于Breakpoint cluster region(BCR)/ABL+白血病患者的治療[14]，有報道達沙替尼也可抑制多種實體瘤細胞，可作為實體瘤治療的候選藥物[15-17]。因此，本研究通過探討達沙替尼與干擾素對Raji細胞的效果，為其應(yīng)用于淋巴瘤特別是EBV+淋巴瘤的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 人BL細胞Raji，購于上海中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI l640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco)，細胞增殖檢測(cell counting kit-8，CCK8)試劑盒(美國Sigma)，細胞周期檢測試劑盒(美國BD)，達沙替尼(上海蓓瑯)，干擾素(北京三元)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑及qRT-PCR試劑(重慶威斯騰)，R反式激活因子(R transactivator，RTA)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(英國Abcam)，Z反式激活因子(Z transactivator，ZTA)抗體(美國Santa cruz)，羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG；美國Sigma)；多功能酶標儀(美國Thermo Fisher)， 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)儀(美國Applied Biosystems)，流式細胞儀(美國BD)，垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、Trans-Blot轉(zhuǎn)膜裝置及電泳儀(美國Bio-Rad)，圖像分析系統(tǒng)(美國LabworksTMAnalysis Softwar)，Tannon-4200凝膠成像系統(tǒng)(中國天能)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 Raji細胞置于含10%胎牛血清RPMI l640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，1～2 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。選擇0.1、0.5、1.0、5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼分別作用Raji細胞12、24及48 h，加CCK8溶液10 μL、孵育4 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(optical delnsity，OD)，據(jù)各組OD值計算細胞抑制率[細胞抑制率(%)=(OD對照組-OD實驗組)/OD對照組×100%]，根據(jù)各處理條件的抑制率計算半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)，并選擇合適的達沙替尼濃度及作用時間。根據(jù)上述實驗結(jié)果和本課題組前期結(jié)果[13]選擇干擾素濃度5×106U/L作為聯(lián)合用藥濃度，分為空白對照組(培養(yǎng)過程中不加達沙替尼及干擾素)、單用組(5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼)及聯(lián)用組(5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼分別聯(lián)合5×106U/L干擾素)

1.2.2CCK8法檢測細胞增殖活性 取“1.2.1”項下空白對照組、單用組及聯(lián)用組Raji細胞，孵育24 h，據(jù)“1.2.1”中CCK8法計算細胞抑制率。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取“1.2.1”項下空白對照組、單用組及聯(lián)用組Raji細胞，孵育24 h，收集細胞；分別加1 mL冰浴預冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定2 h；1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞；加冰浴預冷的PBS 1 mL，重懸細胞；1 000 r/min離心5 min沉淀細胞，每管細胞樣品中加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液0.5 mL，重懸細胞，37 ℃避光溫浴30 min；采用流式細胞儀于488 nm波長處檢測紅色熒光。

1.2.4qRT-PCR法檢測BZLF1和BRLF1 mRNA的表達 取“1.2.1”項下空白對照組、單用組及聯(lián)用組Raji細胞，孵育24 h，收集細胞；TRIzol法提取總RNA，將各組總RNA分別加Random 6mers(50 μmol/ L)1 μL、Dntp Mixture(10 mmol/L)1 μL，余用ddH2O補足體積至10 μL，65 ℃、5 min后冰上冷卻；每組分別加5×PrimeScript 2 Buffer 4 μL、40 U/ μL RNase lnhibitor 0.5 μL、200 U/μL PrimeScript 2 RTase 1μL，余用ddH2O補足體積至20 μL，緩慢混勻后進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，最后冰上冷卻；qRT-PCR擴增反應(yīng)體系為2×PowerUp SYBR Green Master Mix 5 μL、BZLF1或BRLF1 mRNA上下游引物各0.5 μL、核酸模板1 μL、余用ddH2O補足體積至10 μL，擴增條件為50 ℃預變性2 min、95 ℃變性2 min、60 ℃退火1 min、95 ℃延伸15 s,40次循環(huán)。BRLF1正、反向引物分別為5-GAAGAAACCAGTCAGGCCGT-3和5′-TGTTGTGGTCAGTTCGTCCA-3′，BZLF1正、反向引物分別為5′-GGGGCTAACCAAGGACAACA-3′和5′-ATTCCTCCAGCGATTCTGGC-3′，內(nèi)參基因GAPDH正和反向引物分別為5′-AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG-3′和5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。采用相對定量法測定目的基因、內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的Ct值，以2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.2.5Western blot檢測ZTA和RTA蛋白的表達 取“1.2.1”項下空白對照組、單用組及聯(lián)用組Raji細胞，孵育24 h，收集細胞并抽提各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量為20 μg，80 V電壓跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120 V，待溴酚藍跑至膠板底部時停止，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，分別加1 ∶1 000稀釋的ZTA、RTA、GAPDH抗體孵育，4 ℃過夜、洗滌，加1 ∶1 000稀釋的羊抗兔IgG溫育1.5 h、洗滌，ECL曝光液反應(yīng)2 min，采集圖像并進行分析；蛋白條帶灰度值經(jīng)內(nèi)參校正后，根據(jù)灰度值判斷目標蛋白的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 達沙替尼作用濃度的確定

達沙替尼0.1～15.0 μmol/L分別作用于Raji細胞12、24及48 h，0.1 μmol/L達沙替尼作用12 h對Raji細胞即有增殖抑制作用，且隨著濃度增加和作用時間延長、抑制作用逐漸增強(r12 h=0.963 7，r24 h=0.966 4，r48 h=0.901 8，P<0.05)；達沙替尼作用12、24及48 h的IC50濃度分別為18.2 、10.6及7.8 μmol/L?？紤]藥物濃度和細胞培養(yǎng)周期，故后續(xù)實驗分別以5.0、10.0及15.0 μmol/L作為單用組的達沙替尼濃度，聯(lián)用組則為達沙替尼5.0、10.0及15.0 μmol/L分別與干擾素5×106U/L聯(lián)合應(yīng)用，各組作用Raji細胞24 h后檢測相關(guān)指標。見圖1。

注：(1)與同濃度12 h組比較，P<0.05；(2)與同濃度24 h組比較，P<0.05；(3)與同時點0.1 μmol/L達沙替尼組比較，P<0.05；(4)與同時點0.5 μmol/L達沙替尼組比較，P<0.05；(5)與同時點1.0 μmol/L達沙替尼組比較，P<0.05；(6)與同時點5.0 μmol/L達沙替尼組比較，P<0.05；(7)與同時點10.0 μmol/L達沙替尼組比較，P<0.05。

2.2 細胞增殖活性

5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼單用組Raji細胞處理24 h后細胞增殖抑制效應(yīng)呈濃度依賴性(r=0.991 8，P<0.05)；各濃度達沙替尼聯(lián)用組Raji細胞處理24 h后，隨著達沙替尼濃度增加，細胞增殖抑制作用增強(r=0.982 7，P<0.05)；各濃度達沙替尼聯(lián)用組Raji細胞的抑制作用分別均比單用組增強，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各濃度達沙替尼單用組和聯(lián)用組Raji細胞抑制率

2.3 細胞周期

流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，單用組Raji細胞隨著達沙替尼濃度增大，S期細胞比例減少(r=-0.982 3，P<0.05)，G2/M期細胞比例增多(r=0.951 6，P<0.05)，即增殖周期的細胞減少，G2/M阻滯，Raji細胞的增殖被達沙替尼抑制；隨著達沙替尼濃度增大，聯(lián)用組Raji細胞中S期細胞比例減少(r=-0.990 4，P<0.05)，G2/M期細胞比例增多(r=0.945 8，P<0.05)，細胞增殖被抑制，且被抑制的程度明顯比單用組強(P<0.05)。見圖2和表2。

注：A為空白對照組，B～D分別為5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼單用組，E～G分別為5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼與5×106 U/L干擾素聯(lián)用組。

表2 各組Raji細胞的各期細胞比例

2.4 BZLF1和BRLF1基因的表達

各組細胞分別經(jīng)藥物處理24 h后，與空白對照組相比，各單用組Raji細胞均能上調(diào)BZLF1、BRLF1 mRNA的表達(rBZLF1=0.852 4，rBRLF1=0.834 6，P<0.05)；各聯(lián)用組Raji細胞BZLF1、BRLF1 mRNA的表達均上調(diào)，且隨著藥物濃度的增加，BZLF1、BRLF1 mRNA的表達增加(rBZLF1=0.953 5，rBRLF1=0.917 2，P<0.05)，各聯(lián)用組對BZLF1、BRLF1 mRNA的上調(diào)作用強于同濃度單用組(P<0.05)。見表3。

表3 各組Raji細胞BZLF1和BRLF1 mRNA的相對表達量

2.5 ZTA和RTA蛋白表達

Western blot檢測結(jié)果可見，空白對照組Raji細胞中ZTA和RTA蛋白無表達；各單用組Raji細胞中ZTA、RTA蛋白有表達，且隨著藥物濃度的增加，ZTA和RTA蛋白表達增加(rZTA=0.841 7，rRTA=0.953 2，P<0.05)；各聯(lián)用組Raji細胞中ZTA和RTA蛋白有表達，且隨著達沙替尼濃度的增加，ZTA和RTA蛋白的表達增加(rZTA=0.990 2，rRTA=0.953 8，P<0.05)；聯(lián)用組對ZTA、RTA蛋白表達的上調(diào)作用強于同濃度達沙替尼單用組(P<0.05)。見圖3和表4。

注：A為空白對照組，B～D分別為5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼單用組，E～G分別為5.0、10.0及15.0 μmol/L達沙替尼與5×106 U/L聯(lián)用組。

表4 各組Raji細胞的RTA和ZTA蛋白表達

3 討論

酪氨酸激酶與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，酪氨酸激酶活性過高會導致下游信號途徑激活，從而引起細胞轉(zhuǎn)化、增殖、抗凋亡及促生存，最終形成腫瘤[18]。因此，酪氨酸激酶抑制劑是腫瘤治療藥物研發(fā)的一個熱點。達沙替尼作為第2代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑，是一種Src家族的淋巴細胞酪氨酸激酶(lymphocyte cell kinase，LCK)抑制劑，具有ABL和SRC激酶雙重抑制作用，對SFK家族等多種激酶亦有抑制作用，可抑制下游目標基因的自動磷酸化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，是常用的慢性髓細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的靶向藥物之一[19-21]。目前也觀察到其對皮膚、乳腺、骨、肺、結(jié)腸及前列腺等部位的實體瘤也有抑制作用，能夠抑制腫瘤細胞的酪氨酸激酶活性，破壞腫瘤細胞的信號傳導，抑制腫瘤細胞增殖和新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長[22-23]。本研究結(jié)果顯示，達沙替尼對Raji細胞亦有增殖抑制作用，與對其他腫瘤細胞的作用相似。將達沙替尼單用或與干擾素聯(lián)用處理Raji細胞，研究它們對細胞增殖及細胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)達沙替尼能有效抑制細胞增殖且呈濃度依賴關(guān)系，且藥物處理后S期細胞比例減少，G2/M阻滯，與細胞增殖受抑制相符。而達沙替尼與干擾素聯(lián)用后細胞增殖抑制率提高，S期細胞比例減少及G2/M阻滯水平亦較達沙替尼單用時明顯提高。結(jié)果顯示，達沙替尼與干擾素之間具有明顯的協(xié)同作用，這提示對于BL而言，聯(lián)合應(yīng)用達沙替尼和干擾素可能會有較好的療效。

EBV感染有潛伏期和裂解期兩種狀態(tài)[7]。目前，臨床常用阿昔洛韋和更昔洛韋等嘌呤核苷類似物抗病毒藥物來治療EBV感染，這類藥物進入細胞后需要在病毒編碼的激酶作用下三磷酸化，才能形成有活性的形式[24-25]。但是，處于潛伏期的EBV+淋巴瘤細胞不表達病毒編碼的激酶，因此這類抗病毒藥物在EBV+淋巴瘤中不能取得很好的抗病毒效果[7]。誘導EBV進入裂解期的始動基因有BZLF1和BRLF1這兩種基因，裂解期復制的起始很大程度上依賴于BZLF1和BRLF1基因的表達[26]。BZLF1和BRLF1基因的翻譯產(chǎn)物ZTA和RTA蛋白是EBV進入裂解期的關(guān)鍵蛋白，可作為基因轉(zhuǎn)錄的反式作用子引導病毒基因表達期的級聯(lián)反應(yīng)[27]。有研究表明，ZTA和RTA蛋白的表達能夠促使Raji細胞進入S期[28]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在藥物作用下能減少Raji細胞的S期細胞比例，但同時上調(diào)BZLF1及BRLF1 mRNA的表達[29]。在本研究中，達沙替尼單用或與干擾素聯(lián)用均能降低S期細胞比例，同時上調(diào)Raji細胞BZLF1和BRLF1 mRNA表達，促進ZTA和RTA蛋白的產(chǎn)生，與前述研究的后者相印證。有研究發(fā)現(xiàn)，ZTA和RTA蛋白的表達能夠使細胞增殖阻滯在G2/M期[30-31]，本研究的成果與之相符。另有文獻報道，單純皰疹病毒進入裂解期可阻斷細胞進入S期[32-33]，本研究的結(jié)果亦與之相似。在EBV感染導致的腫瘤細胞內(nèi)，潛伏期基因通過激活細胞周期進程導致細胞無限增殖[34]。但當EB病毒被激活進入裂解期，立早基因BZLF1和BRLF1開始表達，基因產(chǎn)物ZTA、RTA蛋白可誘導細胞周期停滯[33-34]。

綜上所述，本研究中，達沙替尼單用或聯(lián)合干擾素均能抑制Raji細胞的增殖，這種抑制可能是通過干擾細胞周期，阻斷Raji細胞進入S期并發(fā)生G2/M阻滯而發(fā)生的；達沙替尼單用或與干擾素聯(lián)用能上調(diào)Raji細胞中BZLF1、BRLF1 mRNA和ZTA、RTA蛋白的表達，表明能夠促使EBV+淋巴瘤中的EBV進入裂解期，這可能是干擾細胞周期從而抑制細胞生長的機制之一。因此，本研究有理由認為達沙替尼能夠有效地抑制Raji細胞增殖，與干擾素聯(lián)合使用效果更加顯著，二者聯(lián)用有可能為EBV+淋巴瘤臨床治療開辟一條新途徑。