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黃連素對(duì)人耐紫杉醇去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞活力、增殖及HMGB1表達(dá)的影響*

2021-07-02 06:25張健彭煜暉李毅梁欣明付文莉張婷柏華禹文峰吳昌學(xué)張啟芳
關(guān)鍵詞:前列腺癌試劑盒耐藥

張健, 彭煜暉, 李毅, 梁欣明, 付文莉, 張婷, 柏華, 禹文峰, 吳昌學(xué)* , 張啟芳*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室, 貴州 都勻 558000)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤,已成為全世界男性癌癥相關(guān)死亡率的第2大原因[1], 因其早期癥狀與前列腺炎相似,常被人忽視,致使多數(shù)前列腺癌患者在被診斷時(shí)已為轉(zhuǎn)移性前列腺癌(metastatic prostate cancer, mPCa)[2]。mPCa通常接受雄激素剝奪治療[3],該療法在早期階段有效,然而許多mPCa患者慢慢發(fā)展雄激素不敏感,即去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)[3]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)通常為CRPC 患者標(biāo)準(zhǔn)治療選藥,PTX是一種生物堿,可通過(guò)作用于細(xì)胞微管發(fā)揮其抗腫瘤作用,但是CRPC對(duì)PTX的耐藥性限制了其治療效果[4]。小檗堿(berberine,BBR)是一種天然生物堿化合物,存在于幾種藥用植物中,如刺檗;因它可從中藥黃連中分離,又稱(chēng)黃連素,是黃連抗菌的有效成分[5]。近幾年研究表明,BBR能通過(guò)不同靶基因有效地抑制幾種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),也可通過(guò)上調(diào)miR-203增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,亦可通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路阻礙黑色素瘤細(xì)胞A375.S2遷移[6-7];BBR可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U87進(jìn)入衰老狀態(tài),不再生長(zhǎng)[8];BBR通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的死亡和凋亡介導(dǎo)的死亡[9]。但是,BBR對(duì)DU145R細(xì)胞的影響機(jī)制尚不清楚。此外,高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)在多種癌組織的表達(dá)也顯著高于相應(yīng)的正常組織[10-11];HMGB1和RAGE共表達(dá)與前列腺癌不良預(yù)后密切相關(guān)[12];小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26中,HMGB1的釋放促進(jìn)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13];HMGB1可通過(guò)激活蛋白激酶B信號(hào)通路從而促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[14]。重要的是,在人耐PTX去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞中抑制HMGB1的表達(dá)后,細(xì)胞增殖受到顯著抑制[15],但在人耐PTX去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞中BBR是否與HMGB1作用尚不清楚。因此,本研究擬探討B(tài)BR是否可通過(guò)HMGB1表達(dá)影響DU145R的細(xì)胞活力和增殖,現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 人前列腺癌細(xì)胞株DU145細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC),人耐PTX去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞株DU145R為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基及澳洲胎牛血清(美國(guó)Gibco),黃連素(中國(guó) 大連美侖生物), 兔抗單克隆抗體HMGB1與HRP標(biāo)記的抗兔的二抗(美國(guó)CST),超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence,ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國(guó)Millipore),二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白Marker(美國(guó)Thermo),抗體稀釋液、封閉液、十二烷基苯硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒(中國(guó)碧云天),PTX和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;美國(guó)Sigma),GeneGnome XRO NPC 化學(xué)發(fā)光成像儀(英國(guó)SYNGENE),Varioskan LUX多通道酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo Fisher Scientific),Bio-Rda MiniⅡ/Ⅲ垂直電泳儀和Bio-Rda powerpacHC高流電源(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人前列腺癌細(xì)胞株DU145及PTX耐藥前列腺癌細(xì)胞株DU145R放于含有10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培養(yǎng)基,5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DU145R細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104個(gè)/孔,接種于96孔板中。使用0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR(即0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR組)處理48和72 h,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK8)檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度(optical density,OD)值,并計(jì)算抑制率[抑制率=(OD對(duì)照組-OD處理組)/OD對(duì)照組×100%]評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.3細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DU145R細(xì)胞,消化重懸制備為單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103接種于6孔板中,DMSO、10及 20 μmol/L BBR處理細(xì)胞(即DMSO組、10 μmol/L BBR組及20 μmol/L BBR組),每3天更換1次含藥物的培養(yǎng)基,14 d后甲醇固定,結(jié)晶紫染色并計(jì)算克隆形成數(shù)量。

1.2.4HMGB1基因表達(dá)分析及預(yù)后分析 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析HMGB1mRNA在人前列腺癌及正常組織中的差異表達(dá),然后利用人蛋白質(zhì)圖譜(human protein atlas , HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析HMGB1在正常組織和前列腺癌中的蛋白表達(dá)差異;使用TIMER2.0在線(xiàn)分析工具分析HMGB1基因表達(dá)于前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系,根據(jù)HMGB1基因表達(dá)中位值將前列腺癌患者分為HMGB1高表達(dá)組與HMGB1低表達(dá)組。

1.2.5蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞DU145作為DU145組,0、10及20 μmol/L BBR處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DU145R細(xì)胞分別作為0、10及20 μmol/L DU145R組,收集各組細(xì)胞,提取總蛋白,蛋白上樣30 μg,80 V恒壓電泳并將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,室溫下孵育HMGB1一抗(1 ∶1 000)2 h,然后孵育抗兔二抗(1 ∶1 000)1 h,ECL超敏化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)蛋白的表達(dá),利用Image J分析圖像強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力

使用0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR處理DU145R48和72 h后,CCK8試劑盒檢測(cè)BBR對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明,與0 μmol/L BBR組相比,各濃度組中DU145R細(xì)胞的抑制率降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖1。

注: 0 μmol/L BBR組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.2 細(xì)胞增殖

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與DMSO組相比,5 與10 μmol/L BBR組DU145R細(xì)胞的克隆形成數(shù)量減少(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖2。

注: 與DMSO組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.3 HMGB1在耐藥細(xì)胞高表達(dá)和與前列腺癌的臨床相關(guān)性

采用Western blot法檢測(cè)了HMGB1在DU145R中的表達(dá),結(jié)果顯示HMGB1在DU145R中的表達(dá)明顯高于DU145細(xì)胞(P<0.001);使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)及HPA分別分析HMGB1在前列腺正常組織與前列腺癌中的mRNA及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,前列腺癌中的HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于前列腺正常組織;利用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲取前列腺癌患者生存數(shù)據(jù),生存分析結(jié)果表明,HMGB1高表達(dá)與前列腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)(P=0.019 3)。見(jiàn)圖3。

注:A、B分別為HMGB1在DU145R中的表達(dá)和定量結(jié)果,C為HMGB1 mRNA 的表達(dá),D、E分別為正常組織和前列腺癌組織中HMGB1蛋白表達(dá)(200×),F(xiàn)為HMGB1表達(dá)與患者生存時(shí)間分析; (1)與DU145細(xì)胞或正常組比較,P<0.001。

2.4 HMGB1的表達(dá)

為了檢測(cè)在DU145R細(xì)胞中BBR是否影響了HMGB1的表達(dá),利用10和20 μmol/L BBR處理細(xì)胞12 h后,Western blot法檢測(cè)HMGB1表達(dá)水平,結(jié)果顯示,10和20 μmol/L BBR組DU145R細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平分別低于0 μmol/L BBR組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示BBR能抑制DU145R細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

注:(1)與0 μmol/L BBR組比較,P<0.05。

3 討論

克服CRPC耐藥性是臨床治療CRPC的一大難題[16]。本課題組前期結(jié)果表明PTX誘導(dǎo)的HMGB1的表達(dá)促進(jìn)CRPC細(xì)胞的PTX耐藥[15]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,BBR處理DU145R細(xì)胞后,細(xì)胞活力及增殖能力分別隨著濃度的增加而降低 (P<0.05),說(shuō)明BBR能夠抑制DU145R細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖;在前列腺癌組織中HMGB1 mRNA水平和蛋白水平明顯高于正常組織(P<0.001),HMGB1高表達(dá)與前列腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)(P=0.019 3),這說(shuō)明HMGB1與前列腺癌具有臨床相關(guān)性;在蛋白水平上,BBR處理下調(diào)了HMGB1的表達(dá),進(jìn)一步揭示了BBR抑制DU145R細(xì)胞活力和增殖的機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞以多種方式對(duì)化療作出反應(yīng),包括誘導(dǎo)和釋放損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)[17]。 DAMP可誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡,從而促進(jìn)宿主抗癌免疫力[12]。HMGB1是DAMP家族成員之一[18]。最近研究報(bào)道,由于前列腺素E2 (prostaglandin,PGE2)的作用,致使HMGB1并沒(méi)有激活免疫活力的能力[17,19]。研究報(bào)道,HMGB1的敲低會(huì)增加細(xì)胞死亡,并在體內(nèi)和體外恢復(fù)癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[20],這表明此敲低可能導(dǎo)致誘導(dǎo)癌癥進(jìn)展和耐藥性。釋放到細(xì)胞外HMGB1可增強(qiáng)化療后幸存的殘余癌細(xì)胞的再生、轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性,例如釋放的HMGB1能夠促進(jìn)骨髓瘤、乳腺癌、 肺腺癌、 前列腺癌、甲狀腺癌及鼻咽癌等細(xì)胞的耐藥性[21-26]。從本研究的結(jié)果可看出,BBR抑制了HMGB1的表達(dá),提示BBR抑制DU145R細(xì)胞活力和增殖與HMGB1相關(guān)。此外,HMGB1在前列腺癌組織中表達(dá)明顯增加,HMGB1高表達(dá)與前列腺患者不良預(yù)后相關(guān)。HMGB1作為檢測(cè)對(duì)前列腺癌診斷指標(biāo)之一[27-28],說(shuō)明HMGB1與前列腺癌具有臨床相關(guān)性。綜上所述,HMGB1是耐藥前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞的理想靶標(biāo)。

有研究發(fā)現(xiàn),BBR能夠抑制順鉑耐藥的胃癌細(xì)胞BGC-823及SGC-7901的活力[29],抑制阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞MCF-7活力及增殖[30]。與本研究結(jié)果相似,BBR能夠有效地抑制DU145R細(xì)胞的活力及增殖。本課題組前期研究結(jié)果表明HMGB1表達(dá)促進(jìn)CRPC細(xì)胞PTX耐藥[11]。本研究結(jié)果顯示BBR可明顯抑制HMGB1在DU145R細(xì)胞的表達(dá)。

綜上所述,BBR可以通過(guò)下調(diào)HMGB1表達(dá)抑制DU145R細(xì)胞活力和增殖,從而發(fā)揮抗腫瘤增殖活性,說(shuō)明BBR有望成為克服PTX耐藥的候選化藥物。本研究未在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,未來(lái)的工作中將在PTX抗性的CRPC小鼠模型中驗(yàn)證BBR是否可抑制PTX耐藥。雖然本研究存在一定的局限性,但發(fā)現(xiàn)BBR能靶向HMGB1,從而為臨床上研究新藥物提供了新靶點(diǎn)。

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