林正英， 楊光偉， 白嬌， 黃建

(1.自貢市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科, 四川 自貢 643000； 2.都江堰市婦幼保健院 檢驗科, 四川 都江堰 611830; 3.自貢市中醫(yī)醫(yī)院檀木林分院 針灸一科, 四川 自貢 643000)

mtDNA突變和核編碼因子的突變會導致廣泛的人類疾病，其中大多數會影響中樞神經系統(tǒng)[1]。mtDNA最初被認為在不受包裝蛋白質束縛的情況下自由漂浮在線粒體基質中，現在已經確定mtDNA與線粒體內膜有關[2]，其功能障礙可能會導致核苷酸結構和組成的改變，從而可能反過來影響mtDNA的分離和膜結構，從而誘發(fā)線粒體疾病[3]。膽固醇動態(tài)平衡紊亂可導致mtDNA異常[4]，參與調控該作用的因子包括ATAD3、ATPase家族以及AAA+結構域[5]。大多數物種只有1個ATAD3基因，而人類則有一個緊密排列的ATAD3C、ATAD3B和ATAD3A 3個基因簇，它們緊密靠近1p號染色體的端粒[6]，ATAD3A突變能夠導致線粒體異常表型[7-9]，其機制尚不明確。本研究旨在探究ATAD3基因簇缺失導致與mtDNA和膽固醇代謝相關的小腦功能障礙的關系，以為臨床診治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

8～12周雄性C57BL/6(n=48)小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物管理中心[生產許可證號SCXK(粵)2016-0041]，將其隨機分為對照組(正常雄性C57BL/6小鼠，n=24)和Atad3缺失組(Atad3 -/-純合缺失C57BL/6小鼠，n=24)，飼養(yǎng)在室溫下、以12 h明/暗交替周期的無病毒-抗原設施中，可隨意獲得食物和水。

1.2 方法

從敲除小鼠項目庫中獲得了胚胎干(ES)細胞克隆，其中內源Atad3已通過同源重組(http://www.komp.org)進行修飾。將含有Atad3陷阱基因的ES細胞系(克隆CDS37385，來自JM8.N4細胞，背景6N)注入C57BL/6J衍生的胚泡中，獲得的胚胎植入假孕的寄養(yǎng)母親體內。為了檢測嵌合體，本研究擴增了煙酰胺核苷酸轉氫酶(Nnt)基因座，該基因座在6N背景下為純合野生型(ES細胞)，而在6J背景下為純合突變體(胚泡)。用于擴增Nnt基因的引物如下：NntA-COMMON為5′-GTAGGGCCAACTGTTTCTGCATGA-3′，NntD-WT為5′-GGGGATAGGAAGCAAATACCAAGTTG-3′，NntC-MUT為5′-GTGGAATTCCGCTGAGAGAACTCTT -3′。使雜合的Atad3 +/-小鼠與普遍表達翻轉酶小鼠(Rosa26_FLP，Jackson Laboratory，012930)交配，以切除新霉素選擇標記。與雜合小鼠Atad3 +/-自交產生的純合后代Atad3 -/-小鼠用于表型研究的所需基因型，隨后將小鼠與C57BL6J一起繁殖了7代以上，取第子代小鼠的成纖維細胞進行實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1采用RT-qPCR檢測ATAD3 mRNA表達水平 用異氟烷麻醉實驗小鼠，斷頭處死，取小腦，-80 ℃儲存，組織勻漿，分離RNA，定量RNA濃度和純度；用DNase I(Promega公司，美國)在37 ℃下處理等量的RNA(1 μg)30 min，在65 ℃滅活DNase 15 min。使用高容量cDNA存檔工具包(Applied Biosystems公司，美國)對RNA進行反轉錄，Taqman qPCR使用JumpStart Taq Readymix(Sigma公司，美國)和ATAD3小鼠特異性Applied Biosystems引物，反應方案包括一個初始升溫時間(2 min，50 ℃；10 min，95 ℃)和40個后續(xù)循環(huán)(15 s，95 ℃；1 min，60 ℃)。與標準曲線比較，計算出目標基因的相對濃度。

1.3.2蛋白質印跡法分析蛋白質表達水平 用異氟烷麻醉實驗小鼠，斷頭處死。取小腦于-80 ℃儲存、勻漿，測定總蛋白質濃度，并在540 nm處測量吸光度。將蛋白質在95 ℃的樣品緩沖液(62.5 mmoL/L Tris-HCl，20%甘油，2%十二烷基硫酸鈉，5%β-巰基乙醇，pH6.8)中變性,等量的蛋白質上樣到預制的聚丙烯酰胺NuPage凝膠(Invitrogen公司，美國)中；蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，用含5%牛奶的Tris緩沖鹽水(TBS，pH7.6)和1%Tween(TBS-T)封閉膜，加入含5%IgG的牛血清白蛋白的一抗(BSA公司，美國)、4 ℃過夜，并在5%牛奶TBS-T中于室溫下過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(BSA公司，美國),顯影，計算條帶的光密度。

1.3.3采用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢查線粒體形態(tài) 活細胞用MitoTracker Red(紅色，線粒體)和PicoGreen(綠色，核和mtDNA)染色，將成纖維細胞以2×104接種在12 mm玻璃蓋玻片上，用抗TOMM20(上海碧云天公司)和LAMP1(上海碧云天公司)的一抗以及Alexafluor偶聯(lián)二抗(上海碧云天公司)進行孵育，在37 ℃下用PicoGreen 3 mL將細胞染色30～45 min，向介質中添加50 nmol/L MitoTracker Red染料(上海碧云天公司)或50 nmol/L MitoTracker Deep Red染料(上海碧云天公司)以可視化線粒體網絡。來自固定樣本和實時樣本的圖像均在由Metamorph軟件操作的Olympus旋轉盤共聚焦系統(tǒng)(Olympus公司，日本)上獲取。通過共聚焦顯微鏡觀察成纖維細胞的線粒體形態(tài)。

1.3.4采用溶酶體聚集體圖像分析溶酶體結構 通過免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢查成纖維細胞系中的溶酶體結構，抗TOMM20(紅色，線粒體)和LAMP1(綠色，溶酶體)的抗體染色，對圖像中正常和增大的溶酶體的細胞數進行評分，以定量分析溶酶體聚集體的存在。

1.3.5采用PureLink Genomic DNA Mini Kit分析mtDNA拷貝數 從小鼠成纖維細胞中提取總基因組DNA(gDNA)與核和mtDNA，使用QuantStudio 6 Flex實時PCR系統(tǒng)(Invitrogen公司，美國)通過實時定量PCR(qPCR)分析相對mtDNA拷貝數。

1.3.6采用HPLC-質譜法測定小鼠的肌肉脂質 取2月齡對照組小鼠和Atad3缺失組小鼠的肌肉組織，用正相HPLC分離甘油磷脂和鞘脂，HPLC條件為Agilent Zorbax Rx-Sil色譜柱(柱長100 mm，內徑0.25 mm)：流動相A(氯仿 ∶甲醇 ∶氫氧化銨=89.9 ∶10 ∶0.1，V/V)和流動相B(氯仿 ∶甲醇 ∶水 ∶氫氧化銨，55 ∶39.9 ∶5 ∶0.1，V/V)，95%A持續(xù)2 min，在18 min內線性梯度達到30%A，并保持3 min。通過反相HPLC分離甾醇和甘油脂，不同的是使用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 μm ×100 μm)。

1.3.7旋轉腳架下落的潛伏時間 采取rotarod試驗進行行為學評分，用旋轉腳架下落的潛伏時間評價小鼠運動的學習能力以及肢體的協(xié)調能力。各組小鼠在造模前均進行行為學訓練，連續(xù)3 d，即在速度為4 r/min的轉輪上勻速訓練跑輪，入組標準為至少持續(xù)60 s。在術后第1、7、14、21及28天，各組小鼠分別使用3個旋轉速度(8、16、24、32和40 r/min)進行rotarod試驗，記錄其行為學評分。使用旋轉腳架設備測量運動協(xié)調和平衡，在每次試驗中，活塞桿均在120 s內加速至最終速度，在最終速度下再保持30 s，最后在30 s內降至0 s，間隔時間為 2 min，記錄每個試驗的旋轉腳架下落的潛伏時間，即小鼠從開始至跌落的時間，重復3次，計算其平均值。整個過程由對實驗分組毫不知情的實驗人員操作。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 ATAD3 mRNA和蛋白質表達水平

與對照組比較，Atad3缺失組的ATAD3 mRNA和蛋白質表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Atad3缺失對ATAD3蛋白表達的影響

表1 兩組ATAD3 mRNA和蛋白表達

2.2 線粒體形態(tài)

與對照組比較，Atad3缺失組纖維細胞中可視化的線粒體網絡碎片化，線粒體斷裂和部分斷裂比例增加，線粒體中間和融合比例降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 兩組細胞中的線粒體結構變化

圖2 兩組成纖維細胞線粒體共聚焦顯微鏡檢查

2.3 溶酶體結構

與對照組比較，Atad3缺失組溶酶體液泡增大，正常溶酶體比例降低，增大溶酶體比例升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 兩組成纖維細胞中溶酶體結構比較

表3 兩組成纖維細胞系中的溶酶體結構比較

2.4 mtDNA拷貝數

與對照組比較，Atad3缺失組mtDNA拷貝數和每個細胞的mtDNA核苷數降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組mtDNA拷貝數和每個細胞的mtDNA核苷數

2.5 小鼠肌肉組織膽固醇水平

在從2月齡鼠的肌肉中提取的樣品中，沒有發(fā)現對照組小鼠和Atad3缺失組小鼠的脂質組成的明顯差異(圖3A)。與對照組比較，5月齡Atad3缺失組小鼠肌肉組織有不同的膽固醇酯分布(圖3B)。Atad3缺失組肌肉在，ER中合成的膽固醇酯水平降低(通常含有短的飽和或單不飽和?；?，從飲食中獲得的膽固醇酯水平升高(通常含有更長和更多的不飽和?；?；總膽固醇酯/游離膽固醇的定量水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 總膽固醇相關的不同膽固醇酯肌肉組織脂肪分析

表5 肌肉組織總膽固醇/游離膽固醇比值

2.6 旋轉腳架下落的潛伏時間

不同的旋轉速度(8、16、24、32和40 r/min)下，Atad3缺失組小鼠旋轉腳架下落潛伏時間低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 兩組小鼠旋轉腳架下落的潛伏時間比較

3 討論

本研究使用ATAD3基因敲除小鼠模型研究了線粒體內膜ATPase ATAD3的體內功能。ATAD3的缺失可導致線粒體超微結構受損，mtDNA復制停滯，總膽固醇酯/游離膽固醇的比率降低，以及小腦功能障礙。線粒體在類固醇生成中具有重要作用[10-11]。膽固醇產物的缺乏可誘發(fā)伴隨ATAD3缺失的小腦功能異常。與致命的嬰兒ATAD3B/ATAD3A基因融合缺陷相反，隱性和從頭顯性的ATAD3A錯義突變與輕度形式的小腦功能障礙和更廣泛的神經系統(tǒng)疾病和多系統(tǒng)疾病有關[12]，即ATAD3A的錯義突變會導致ATAD3的一部分功能喪失或引起功能異常，而不是因為ATAD3A位點的雙等位基因缺失導致嚴重的蛋白質缺乏[13]。在ATAD3缺失動物中，mtDNA的減少伴隨著mtDNA重排的形成，該重排在年長的動物中積累[14]。保留的mtDNA序列包括D環(huán)區(qū)域以及12S和16S核糖體RNA基因。這種缺失模式與在病理狀態(tài)下發(fā)現的重排分子非常相似，例如成人發(fā)作性進行性眼外肌麻痹和MNGIE[15]。

本研究顯示，ATAD3缺失導致纖維細胞中可視化的線粒體網絡碎片化，線粒體斷裂和部分斷裂比例增加，線粒體中間和融合比例降低。線粒體是影響膽固醇代謝的關鍵細胞器，而ATAD3調節(jié)線粒體的膽固醇供應。由ATAD3缺乏引起的膽固醇生物合成的線粒體信號優(yōu)先于細胞的其余部分，這表明將線粒體膽固醇水平保持在嚴格范圍內非常重要[16]。膽固醇代謝紊亂對mtDNA的影響表明，將膽固醇插入線粒體內膜對于mtDNA復制和分離很重要[17]。線粒體內膜中的膽固醇含量低或分散，有望改變其剛性，從而阻礙mtDNA分離[18]。膽固醇和線粒體的完整性都與神經變性有關。本研究顯示，在5周齡的動物中，與對照組比較，Atad3缺失組肌肉中總膽固醇酯/游離膽固醇的定量水平降低。膽固醇可能是與ATAD3缺陷相關的病理學的關鍵因素，該觀點得到了與膽固醇相關的遺傳性疾病中小腦功能障礙的支持[19]。小腦在調節(jié)高階認知和行為功能中起著重要作用，小腦發(fā)育不全通常與Smith-Lemli-Opitz綜合征有關，后者是膽固醇合成的隱性疾病，而小腦功能障礙是C型Niemann-Pick疾病的特征[20]。存在mtDNA異常C型Niemann-Pick疾病和ATAD3缺失障礙表明，這些可能是小腦病理的主要驅動因素。本研究顯示，ATAD3缺失導致小腦功能障礙，線粒體內膜AAA蛋白ATAD3A的功能在膽固醇向線粒體的運輸中發(fā)揮關鍵作用， AAA蛋白是通過形成六聚體環(huán)狀結構發(fā)生作用，ATP酶的催化作用需要底物的配合，且異常線粒體過度分裂形態(tài)與溶酶體空洞有密切關聯(lián)。

綜上所述，ATAD3缺失主要破壞了線粒體結構，導致線粒體斷裂，并增加了溶酶體液泡大小，導致膽固醇向線粒體的運輸被下調，mtDNA復制停滯以及mtDNA的耗竭和缺失，最終導致小腦功能障礙。