陳天鳴， 潘耀振

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004; 貴州省腫瘤醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550001)

肝細胞癌(HCC)是最常見的肝惡性腫瘤之一，高度惡性、預(yù)后較差。合適的肝腫瘤動物模型對于肝癌診斷和各種治療方法的研究很重要。兔VX2肝腫瘤生長迅速，其動脈血供與人類肝癌相似，且腫瘤大小足以通過臨床影像觀察到[1]，因此，兔VX2肝腫瘤模型已廣泛用于肝腫瘤研究的各個方面。動物模型成功建立取決于在兔肝中有效接種VX2并生長形成腫瘤，因此在某種程度上，腫瘤接種技術(shù)的改進必定會對HCC的進一步研究提供幫助。以往研究中有通過剖腹術(shù)、超聲或計算機體層成像(computerized tomography, CT)引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺植入腫瘤細胞懸液和腫瘤碎片等方法進行兔肝臟VX2腫瘤的復(fù)制，但是都有缺陷[2]，常會出現(xiàn)移植瘤處肝表面及臨近腹壁發(fā)生轉(zhuǎn)移，進而影響實驗結(jié)果[3]。本探究對兔VX2肝癌模型的制作方法進行了改良，并就其影像學(xué)進行評價，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性實驗用新西蘭白兔，約3～4月，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.1.2主要儀器與試劑 4F血管鞘及穿刺針、2.7F同軸微導(dǎo)管購于日本Terumo公司，外科手術(shù)器械盒、陸眠寧Ⅱ由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供， GE signa ExciteⅡ1.5T超導(dǎo)型磁共振成像儀、AW4.1工作站購于美國GE Healthcare公司，64排螺旋CT購于荷蘭Philips公司，釓噴酸葡胺注射液、碘海醇購于中國上海GE醫(yī)療公司，HE染色試劑盒購于廣州晶欣生物科技有限公司，CD31抗體、免疫組化試劑盒購于丹麥Dako公司。

1.2 方法

1.2.1VX2腫瘤組織制備 隨機選擇2只兔在麻醉狀態(tài)下，將VX2細胞懸液0.2 mL注射到兔雙后肢外側(cè)肌肉中；植入3周后，腫瘤增長到直徑約3 cm，對兔子實施安樂死，在無菌條件下暴露并剝離位于后肢外側(cè)深部肌肉內(nèi)的VX2腫瘤組織，仔細剔除腫瘤組織周圍的肌肉、血管及筋膜組織，用0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗腫瘤中心壞死組織，留取瘤塊周圍生長旺盛半透明魚肉樣、富有彈性的、活性較高的VX2腫瘤組織，將腫瘤組織剪成大小約1 mm3的瘤塊碎片，進行接種。

1.2.2肝臟VX2腫瘤模型的建立 待接種的實驗兔術(shù)前常規(guī)禁飲食8 h，提前做好中上腹部脫毛、備皮準備；待麻醉起效后，將實驗兔仰臥位固定于操作臺，嚴格按照外科無菌操作步驟常規(guī)消毒術(shù)區(qū)皮膚，在CT引導(dǎo)下利用3D打印模板上孔洞進行經(jīng)皮肝穿刺，將16G的針刺入16只健康兔肝左葉實質(zhì)中，并注入0.2 mL碘海醇確認針尖避開了肝內(nèi)血管與膽管；植入1 mm3VX2腫瘤組織，在確認無誤后用注入纖維蛋白膠1 mL，封堵穿刺通道以固定VX2腫瘤片段，拔出針頭用明膠海綿輕輕按壓穿刺處3 min，以防VX2腫瘤外溢及穿刺通道的出血。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素40萬單位肌肉注射。

1.2.3CT與MRI檢測 分別在影像檢查前禁食12 h和禁水6 h，CT采用平掃與增強掃描結(jié)合，觀察腫瘤種植情況及大小。先平掃定位，后序貫動態(tài)三期增強掃描，采集時間分別為動脈期(15 s)、靜脈期(25 s)和延遲期(45 s)。造影劑選用碘海醇，采用高壓注射器設(shè)定0.5 L/s的速率注射純造影劑5 mL。設(shè)置掃描參數(shù)：管電壓120 kV，管電流106 mA。MRI采用平掃與增強掃描結(jié)合，在植入后第14天所有模型兔應(yīng)用帶有單獨的與SENSE兼容的體部相控陣線圈(人類膝蓋線圈，上海晨光醫(yī)療技術(shù)有限公司)，共由8個單元組成在配有SENSE軟件的Ingenia3.0T數(shù)字化MR掃描機上進行DWI(軸向)和MRI(T1WI和T2WI，軸向)檢測，使用毛巾包裹模型兔的腹部，以減少呼吸運動偽影。所有的檢查都以相同的參數(shù)進行，方案如下：T2-TSE成像參數(shù)[重復(fù)時間(time of repetition, TR) 1 129 ms, 回波時間(time of echo, TE) 80 ms，時間(time, T)17 s，重建體素(reconstruction voxel, REC voxel) 0.78/0.78/4.00 mm，翻轉(zhuǎn)角(flip angle, FA) 125 deg，視野(field of view, FOV) 400 mm×330 mm；層數(shù)，軸位15層，層厚(slice thickness, ST) 4.0 mm，層間距(slice gap, SG) 0 mm，信號平均次數(shù)(number of signal averaged, NSA) 1]、T1-TFE成像參數(shù)[TR/TE為10/2.3，T為14 s，REC Voxel為0.93/0.93/4.00 mm，F(xiàn)A為15 deg，F(xiàn)OV為400 mm×330 mm；層數(shù)，軸位15層，ST為4.0 mm，SG為0 mm，NSA為1]、DWI的參數(shù)[TR/TE為749/70, T為36 s，REC Voxel為1.25/125/4.00 mm,FA為90 deg，F(xiàn)OV為400 mm ×330 mm；層數(shù)，軸位15層，ST為4.0 mm,SG為0 mm,NSA為1]。在完成T1、T2前5次基線測量后，使用自動注射器(Mallinckrodt，C1213D005X1ml)以馬根維顯1 mL即釓噴酸葡胺(Gd-DTPA約0.2 mmol / kg體質(zhì)量)通過左右耳靜脈以2 mL/ s的劑量推注，進行DCE-MRI，在靜脈注射造影劑(contrast agent，CA)之前和之后依次采集組織的磁共振圖像進行DCE-MRI圖像分析。將獲得的DCE-MRI圖像發(fā)送到Tissue-4D工作站(Toft模型)，從而導(dǎo)出以下參數(shù)：(1)體積轉(zhuǎn)移常數(shù)K(K volume transfer constant, Ktrans)為造影劑從血管內(nèi)到血管與細胞之間間隙(extravascular extracellular space，EES)的傳輸速率；(2)回流速率常數(shù)(return rate constant, Kep)為造影劑從EES到血管內(nèi)腔的的體積；(3)容積分數(shù)(fraction by volume, Ve)為間接代表組織中細胞密度，Ve=Ktrans/Kep；(4)初始1 min釓濃度時間曲線下面積(area under curve/initial area under the contrast concentration versus time curve，iAUC60)表示造影劑的劑量從注射點到60 s時的時間強度曲線(time intensity curve，TIC)，由腫瘤血液供應(yīng)和內(nèi)皮通透性決定的最常用的半定量參數(shù)。在灌注成像上選擇腫瘤的最大掃描層面或兩個最大相鄰層面通過軟件獲取參數(shù)Ktrans、Kep、Ve和iAUC60值。

1.2.4組織觀察 在完成CT、MRI檢查之后，每只模型兔予以安樂死，然后取出肝臟標本確定肝臟中的腫瘤生長情況，使用蘇木精-伊紅(HE)染色收集所有肝臟腫瘤進行病理檢查。

1.2.5微血管密度(microvessel density，MVD)檢測 使用針對CD31的單克隆抗體的常規(guī)免疫組織化學(xué)方法標記血管內(nèi)皮細胞，癌細胞間質(zhì)內(nèi)有孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細胞、細胞簇或血管腔面積<8個紅細胞，且管壁無肌層代表1條單獨的微血管。先在低倍鏡下找腫瘤組織內(nèi)MVD最高區(qū)域，然后在200倍視野下計數(shù)3個視野內(nèi)的微血管數(shù)，再將總數(shù)除以3，取其平均值作為腫瘤該視野下的MVD。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟VX2腫瘤模型的建立

從2只兔后肢接種VX2腫瘤細胞處獲取VX2腫瘤組織，接種于剩余16只兔的肝臟中，肝臟移植瘤種植術(shù)后動物進食量減少、飲水量增多，2～3 d后逐漸恢復(fù)術(shù)前飲食狀況，活動及二便基本正常；在植入過程中未觀察到動物死亡和感染。

2.2 CT檢查

于種植術(shù)后第14天行肝癌CT平掃，16只兔均接種成功，腫瘤均位于肝左外葉，且每只兔均只有一個病灶；接種后第14天，腫瘤平均大小為1.9 cm×1.1 cm，表現(xiàn)為低或等密度結(jié)節(jié)或腫塊影，與周圍正常肝實質(zhì)邊緣欠清(圖1)；增強掃描，動脈期腫瘤明顯強化呈環(huán)形高密度影，門脈期腫瘤密度降低至等密度，邊緣及正常的肝實質(zhì)增強，靜脈期表現(xiàn)為腫瘤密度低于正常肝實質(zhì)(圖2)。

注:A為左肝低密度腫塊，B和C為等密度腫塊。

注:A為動脈期，B為門脈期，C為靜脈期。

2.3 MRI檢查

種植術(shù)后第14天行肝癌MRI檢查，結(jié)果顯示兔肝左葉腫瘤在T1W圖像為低信號，T2W圖像和DW圖像為高信號。增強MRI顯示兔肝左葉腫瘤呈邊緣環(huán)狀強化影，可在靜脈注射造影劑之前和之后依次采集組織的磁共振圖像進行DCE-MRI圖像分析，獲取參數(shù)Ktrans、Kep、Ve和iAUC60值。見圖3和圖4。

注:A為軸向T1W圖，B為軸向T2W圖，C為DW圖(b為800 s/mm2)，D為冠向T2W圖。

注：A為腫瘤軸向T1W圖，B為軸向T2W圖，C為冠向T2W圖，D為軸向DW圖(b為800 s/mm2)。

2.4 腫瘤組織觀察

肉眼可見肝內(nèi)直徑約1.5 cm的灰白色、魚肉樣結(jié)節(jié)，與正常肝組織分界清楚，呈圓形、質(zhì)硬(圖5)。HE染色：腫瘤組織中毛細血管多，結(jié)締組織少；腫瘤細胞形態(tài)多樣、體積大、排列不規(guī)則，呈巢狀分布；細胞核明顯不均一、胞核大且深染，提示肝內(nèi)VX2腫瘤接種成功(圖6～8)。

注:A為肝臟及移植瘤，B為肝臟移植瘤。

注：A為200×，B為400×。

2.5 MVD

顯微鏡觀察結(jié)果顯示，兔腫瘤組織中染成棕色具有管腔的內(nèi)皮細胞簇形成微血管或不具有管腔的內(nèi)皮細胞簇的內(nèi)皮細胞，見圖7。16只兔子肝VX2腫瘤中平均MVD為(23.858±2.115)個/視野。

注：A箭頭處為微血管管腔(100×)，B箭頭處為內(nèi)皮細胞簇(400×)。

2.6 Ktrans、Kep、Ve、 iAUC60與MVD的相關(guān)性

Ktrans和iAUC60與MVD正相關(guān)(Ktrans：r=0.545，P=0.029； iAUC60：r=0.553，P=0.026)，而Kep和Ve與MVD不相關(guān)(Kep：r=0.048，P=0.059；Ve：r=0.297，P=0.265)。見表1和圖8。

表1 兔腫瘤組織Ktrans、Kep、Ve、iAUC60及MVD

注：A為Ktrans與MVD的相關(guān)性，B為Kep與MVD的相關(guān)性，C為Ve與MVD的相關(guān)性，D為 iAUC60與MVD的相關(guān)性。

3 討論

本研究通過3D打印模板改進CT引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺將活性VX2腫瘤組織碎片植入家兔的肝臟，接種2周后行CT、MRI檢測及肝組織病理檢查驗證模型建立情況，結(jié)果顯示16只兔肝臟內(nèi)均成功接種VX2腫瘤，兔成瘤位置精準，成功率100%。穿刺靶點設(shè)在左葉中部位置，并注入碘海醇0.2 mL確認針尖避開膽管和血管系統(tǒng)，無大血管損傷及膽瘺發(fā)生。植入腫瘤后再用纖維蛋白膠1 mL注入封堵針道，以防VX2腫瘤外溢及誤入肝竇與肝內(nèi)小血管中，拔出針頭用明膠海綿輕輕按壓穿刺處3 min，以避免異位種植發(fā)生。均該模型成功建立可以為肝癌的影像學(xué)診斷和治療研究提供很好的平臺。

兔肝癌接種模型較多，從接種途徑角度可分為開腹直接接種法與影像引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺接種法，前者因創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多以及易種植轉(zhuǎn)移而逐漸被后者取代[2,4]。目前影像引導(dǎo)主要有CT與超聲兩種手段[5]。本研究結(jié)果表明，CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺將活性VX2腫瘤組織碎片植入家兔肝臟并用纖維蛋白膠注入封堵針道方法優(yōu)點有：精準引導(dǎo)、簡單易行，可減少對肝臟的傷害，縮短手術(shù)時間，降低死亡率及開腹與常規(guī)影像引導(dǎo)的穿刺并發(fā)癥，減少腹腔種植、腹壁浸潤，從而大大提高模型建立的成功率。但此操作也存在不便之處，如CT無法實施超聲引導(dǎo)下實時監(jiān)測進針路徑、實時調(diào)整針尖位置功能，也無法提供彩超操作的實時動態(tài)圖像，相比之下，操作更為復(fù)雜[6]。本研究所得數(shù)據(jù)結(jié)果表明該改進對更精準的構(gòu)建兔VX2肝腫瘤模型有利，具有一定推廣意義。如在本研究基礎(chǔ)上與超聲引導(dǎo)進行前瞻性對比研究，或許能進一步改良兔VX2肝腫瘤模型的建立方法，對肝細胞癌研究的意義深遠。兔VX2肝癌通常在VX2腫瘤組織植入后第14天表現(xiàn)出最佳的腫瘤生存力，而沒有明顯的壞死。因此，本研究中的所有模型兔均在手術(shù)后第14天進行MRI檢測，以確保肝臟中腫瘤結(jié)節(jié)的形成。

CT增強是用于檢查肝占位的一種有效手段，接種后2周左右時可見邊界清楚的低密度結(jié)節(jié)，增強造影可觀察到動脈早期明顯強化，門靜脈期呈較低密度與周圍肝組織分界較清楚，3周以上瘤灶大多出現(xiàn)明顯壞死。本研究也發(fā)現(xiàn)所有VX2腫瘤2周左右時均表現(xiàn)出相同的增強模式：首先顯示出腫瘤外圍區(qū)域的增強，并且由于壞死而觀察到弱的腫瘤內(nèi)增強。盡管如此，對于小肝癌的診斷MR成像明顯優(yōu)于CT[7]，在進行多序列、多方位、多角度顯示時，CT增強檢測不如MRI增強靈敏、精準、全面。本研究結(jié)果還顯示肝癌在核磁T1加權(quán)上顯示低信號，T2加權(quán)稍高信號，增強后瘤灶呈邊緣環(huán)狀強化。

近年來灌注成像以評估腫瘤血管生成的非侵入性和可重復(fù)性成像方法已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，DCE-MRI作為一種灌注成像，可用于評估射頻、微波、冷凍等各種局部腫瘤消融及抗血管生成藥物和血管破壞療法的療效[8-9]，可惜的是目前有關(guān)兔VX2動物模型中對DCE-MRI參數(shù)和MVD之間關(guān)系研究報道較少。本研究結(jié)果顯示采用DCE-MRI灌注成像技術(shù)可大大提高1cm左右瘤灶的檢出率，DCE-MRI的參數(shù)(Ktransand iAUC60)和MVD之間的顯著相關(guān)，與既往的研究結(jié)果相似[10]。DCE-MRI參數(shù)可以提供有關(guān)血管血液灌注和血管通透性的功能性信息，這些信息廣泛用于評估肝腫瘤患者抗血管治療，并作為影像學(xué)生物標志物來預(yù)測治療效果和生存率[11-12]。眾所周知，腫瘤血管生成的主要介質(zhì)是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，VEGF和MVD表達之間呈正相關(guān)[13-14]，因此，病理學(xué)家通常使用MVD計數(shù)來說明微環(huán)境的變化，而MVD表達以CD31的表達來顯示[15]。但應(yīng)用病理上MVD計數(shù)方法在臨床及諸多實驗中無法應(yīng)用，因此人們一直在尋求通過無創(chuàng)的成像技術(shù)檢測微環(huán)境的變化。已證明MRI是一種用于獲取有關(guān)腫瘤微脈管系統(tǒng)信息的非侵入性和非電離方法，它提供了多種獲取血管信息的方法，MRI方法包括動脈自旋標記，動態(tài)磁化率對比MRI，血液氧合水平依賴性成像和DCE-MRI[16-17]，其中，DCE-MRI是一種提供血管信息的體內(nèi)成像方法，已成為臨床前和臨床研究的重要工具[11,18]?；贑A的首過效應(yīng)在T2加權(quán)DCE-MRI效果是瞬間的，因此獲取的圖像單一，這在肝臟研究中價值有限；相比之下，T1加權(quán)DCE-MRI通常能在更長的時間內(nèi)測量組織中CA的積累，可以依時間變化采集組織上T1加權(quán)信號強度的演化曲線，因此，T1加權(quán)DCE-MRI技術(shù)更常用于肝癌研究。

Tissue-4D軟件基于Toft的單輸入兩室藥代動力學(xué)模型，該模型描述了造影劑在血漿和血管外細胞外區(qū)室之間的運輸，并估計了血漿和EES之間的Ktrans，EES和血漿之間的Kep以及EES的Ve。同時計算出來自濃度-時間曲線的半定量參數(shù)iAUC60，對血管生成及微循環(huán)中血流狀況進行簡單而可靠的估計，并可較容易地進行比較研究[19]。本研究之所以選擇該模型，是因為VX2肝腫瘤從肝動脈獲得大量血液供應(yīng)，并且血液分布在血漿和EES兩個腔室中。

本研究的實驗結(jié)果提示Ktransand iAUC60有望以無創(chuàng)方式評估腫瘤血管生成，但這一結(jié)論還有待進一步研究。(1)MVD測量是一種定量的形態(tài)學(xué)指標，受ROI的限制，不能反映組織微脈管系統(tǒng)的所有功能特性，包括DCE-MRI測量的通透性。(2)DCE-MRI中分析的參數(shù)與MVD計數(shù)之間的成像和病理學(xué)不完全匹配。(3)在有限數(shù)量的動物模型中存在潛在的偏倚，病理與MRI表現(xiàn)之間的相關(guān)性需要進一步研究。(4)動脈輸入功能的參數(shù)是為人體設(shè)計的Tissue-4D軟件(SIEMENS)的內(nèi)置數(shù)據(jù)，因此當使用它來評估實驗兔的數(shù)據(jù)時仍然存在系統(tǒng)錯誤。

總之，簡單而有效的用纖維蛋白膠通過16G鞘管針將腫瘤碎片置入肝臟，顯著提高了建模的成功率，并有效減少了并發(fā)癥的產(chǎn)生，使腫瘤細胞植入后的肝內(nèi)種植轉(zhuǎn)移概率顯著下降，這可能是誘導(dǎo)肝腫瘤的一種有應(yīng)用前景的有效方法。如此獲得的較為理想肝臟VX2腫瘤模型，可通過CT及MRI增強實時且準確地評估腫瘤的血管生成和血流灌注，為諸如敏感藥物篩選、藥物有效性和毒副作用研究、外科消融、外科手術(shù)以及相關(guān)腫瘤微環(huán)境等相關(guān)研究提供平臺，對肝癌動物水平上的研究有著重要意義，并對進一步研究提供了新的思路。