羅 晶，顏夢婷，李培旭，張翠平，傅 紅

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

12-羥基硬脂酸（12-hydroxystearic acid，12-HSA）在油脂中因其凝膠劑量低[1]、相對無毒[2]和易獲得，被認為是一種理想的低分子質(zhì)量有機凝膠劑[3]，其凝膠化油脂已廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥和化妝品中[4-5]。2009年，為了在食品中降低由飽和脂肪及反式脂肪引起的健康隱患，12-HSA首次作為新型的結(jié)構(gòu)化凝膠劑應用于如涂抹醬、巧克力糖果及保健食品的食用油脂體系[6-9]。研究表明12-HSA具有獨特的纖維狀晶體，常作為研究凝膠化油脂在不同環(huán)境下晶型變化的典型代表[10]，同時其還能減緩巧克力因油遷移引起的脂肪起霜[8]，控制部分食品基質(zhì)中生物活性化合物的釋放速率并提高生物利用度[9]，因此發(fā)展前景廣闊。目前，對12-HSA的研究主要集中于其凝膠化油脂的機械性能及晶體結(jié)構(gòu)等方面[11-12]，但不可忽略的是，抑制凝膠化油脂的氧化對保障油脂品質(zhì)安全具有重要意義[13]。由于有機凝膠化食用油脂的研究起步較晚，目前對12-HSA的氧化議題尚鮮有具體的相關(guān)文獻報道。

12-HSA是分子結(jié)構(gòu)上含有一個12位羥基取代的十八碳脂肪酸。同其他脂肪酸相比，12-HSA羥基和羧基兩種官能團的相互作用能夠形成分子間氫鍵，有助于自組裝成分子聚集態(tài)并形成晶體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)使液態(tài)油脂結(jié)構(gòu)化，并促使其凝膠化油脂的效率加倍[14-15]。在氧化機理方面，已有研究發(fā)現(xiàn)含有一個羧基的硬脂酸能顯著增加油脂的頂空耗氧量，有明顯的促氧化作用[16]；同時，其他凝膠化油脂的氧化研究結(jié)果表明，固態(tài)凝膠結(jié)構(gòu)能一定程度地減少氧氣進入油相，從而減緩氧化的發(fā)生[17-18]。鑒于上述機理，同時考慮到凝膠劑官能團對油脂真實氧化指標的檢測干擾[19]及其對氧化的潛在影響[20]，本研究圍繞12-HSA凝膠劑對油脂熱氧化的作用機理，討論12-HSA凝膠劑對油脂氧化指標的影響；對比硬脂酸、硬脂醇和十八烷分子，探究12-HSA的羥基或羧基官能團對油脂氧化的作用；在此基礎(chǔ)上通過室溫及熱加工時凝膠狀態(tài)的不同，研究凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對油脂氧化的影響；并利用核磁共振氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）法對12-HSA凝膠化油脂的熱氧化狀態(tài)進行分析。以期為提高12-HSA凝膠化食用油脂的氧化品質(zhì)和規(guī)?；瘧锰峁├碚摵蛿?shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龍魚一級大豆油 上海嘉里特種油脂有限公司；12-HSA、硬脂酸（均為工業(yè)級） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；硬脂醇、十八烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鉀（分析純） 西隴科技股份有限公司；氘代氯仿（光譜純，含體積分數(shù)0.03%四甲基硅烷） 美國CIL公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYT-PC01電位滴定儀 中科譜創(chuàng)儀器有限公司；MCR302流變儀 奧地利安東帕有限公司；BK-POLR偏振光顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；Q2000差示掃描量熱儀 美國TA公司；7890B氣相色譜儀（配有7697A頂空進樣器和CP7538毛細色譜柱） 美國Agilent有限公司；NMR波譜儀（氫譜，500 MHz） 德國布魯克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝膠化油脂制備與實驗分組

選取大豆油作為基料油，稱取一定質(zhì)量的大豆油加熱攪拌，溫度升至61 ℃時分別添加相應質(zhì)量的12-HSA、十八烷、硬脂醇和硬脂酸（溶劑為大豆油），繼續(xù)加熱攪拌至融化完全，加熱總時長（包括升溫時間）為7 min，制備完成后倒入樣品瓶中儲藏于25 ℃下冷卻備用?？瞻捉M只含有大豆基料油，其余加熱步驟相同。

第一組：分別將含有添加量0.2%（以大豆油質(zhì)量計，下同）、0.4%、0.6%和0.8%的十八烷、12-HSA、硬脂醇及硬脂酸油脂產(chǎn)品（6 g，下同）的頂空瓶（規(guī)格為12 mL，下同）置于45 ℃下儲存5 d，冷卻至室溫后測定其頂空耗氧量。

第二組：分別將含有添加量1%、2%、3%、4%和5%的12-HSA凝膠化油脂的頂空瓶置于25 ℃下儲存15 d后，測定其頂空耗氧量、流變學特性、微觀結(jié)構(gòu)。

第三組：將含有添加量2%的12-HSA凝膠化油脂的頂空瓶分別置于30、60、90、120、150 ℃中加熱2 h，冷卻至室溫后測定其頂空耗氧量。

第四組：將含有添加量2%的12-HSA凝膠化油脂置于70 ℃下避光儲存35 d。在氧化0～6 d階段每隔3 d取樣，氧化6～35 d階段，每天取樣。每次均取20 g油樣，進行氧化指標及1H-NMR測定。

1.3.2 凝膠化油脂氧化指標的測定

酸價的測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》；過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》；茴香胺值的測定參照GB/T 24304—2009《動植物油脂 茴香胺值的測定》；總氧化值（total oxidation value，TOTOX）為茴香胺值與4 倍過氧化值之和[21]。

1.3.3 頂空耗氧量的測定

采用7890B氣相色譜儀（熱導檢測器）：檢測器溫度230 ℃；載氣He，流速5 mL/min；進樣口溫度120 ℃；柱溫25 ℃；尾吹氣為He，流速為3 mL/min；分流比50∶1[17]。頂空瓶中的氧氣剩余量會因油脂氧化而發(fā)生變化，頂空耗氧量根據(jù)公式（1）進行計算[22]。

1.3.4 流變性質(zhì)的測定

采用MCR302流變儀測定流變性質(zhì)，振蕩頻率為0.1～100 Hz，振蕩應力為0.1%（線性黏彈區(qū)內(nèi)），測定在25 ℃下添加量1%、2%、3%、4%和5% 12-HSA凝膠化油脂儲能模量隨振蕩頻率的變化[23]。

1.3.5 偏振光顯微鏡觀察

將適量12-HSA凝膠化油脂樣品置于載玻片上，蓋上蓋玻片輕壓成透明薄片，用連接Canon數(shù)碼相機的偏振光顯微鏡觀察樣品的結(jié)晶形態(tài)，放大倍數(shù)為100[12]。

1.3.6 差示掃描量熱儀測定熱穩(wěn)定性

分別稱取適量添加量2%的12-HSA凝膠化油脂樣品置于坩堝內(nèi)，壓緊密封。采用程序控溫，先以10 ℃/min的速率將樣品從室溫加熱至150 ℃，再以20 ℃/min的速率降至室溫，測定其熱力學曲線[13]。

1.3.71H-NMR圖譜的測定

將1 mL凝膠化油脂樣品溶解于5 mL氘代氯仿（CDCl3）混勻后，取0.6 mL混合液裝入核磁管中，在室溫下平衡5 min進行測定。以四甲基硅烷（δ＝0）為內(nèi)標，譜寬δ0～20、掃描次數(shù)16 次、脈沖間隔2 s、脈沖序列zg30，測定樣品的1H-NMR圖譜。利用Bruker TOPSPIN2.1軟件對1H-NMR圖譜進行基線校正與相位校正，然后進行后續(xù)積分處理[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復測定3 次，采用Origin 2019軟件作圖，采用SPSS 19軟件通過單因素方差分析和Tukey's多重比較分析樣品之間的顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 12-HSA凝膠劑對大豆油脂酸價的影響

12-HSA作為新型的食用油脂凝膠劑，其分子官能團可能參與油脂氧化指標檢測過程中的滴定反應或比色反應，進而無法準確反映油脂的氧化狀態(tài)。本研究在過氧化值、茴香胺值及丙二醛值的氧化指標測定中，未發(fā)現(xiàn)12-HSA凝膠劑能夠參與或干擾上述指標的檢測過程，且發(fā)現(xiàn)上述指標均與頂空耗氧量呈良好的正相關(guān)關(guān)系（數(shù)據(jù)未顯示）。但是在酸價的測定中，發(fā)現(xiàn)油脂的實測酸價和凝膠化油脂中12-HSA的質(zhì)量（大豆油質(zhì)量（10 g）×添加量/%）呈正相關(guān)關(guān)系，具體如圖1A所示。同時結(jié)果還表明，單獨的12-HSA凝膠劑在滴定過程中消耗KOH滴定液（圖1B），導致實測酸價比油脂中游離脂肪酸所反映的真實酸價更高。這是由于12-HSA含有能電離出氫離子的羧基或羥基，氫離子消耗了KOH滴定液。因此在測定12-HSA凝膠化油脂的游離脂肪酸真實酸價時，應扣除12-HSA凝膠劑對KOH滴定液的消耗[19]（公式（2））。

圖1 12-HSA凝膠劑對大豆油脂酸價的影響Fig.1 Effect of 12-HSA on acid value of soybean oil

綜上，大部分傳統(tǒng)氧化測定方法只能研究氧化的部分產(chǎn)物，但是頂空耗氧法能動態(tài)地反映油脂氧化中氧氣消耗的量，對氧化的評價更直觀且更加準確[17-19]，因此本研究選用頂空耗氧法作為后續(xù)的氧化測定方法。

2.2 12-HSA官能團對大豆油脂氧化的影響

12-HSA是分子結(jié)構(gòu)上含有12位羥基及頭端羧基兩種官能團的脂肪酸。同12-HSA相比，十八烷缺少了12位羥基和頭端羧基，而硬脂醇及硬脂酸分別只含有這兩個官能團中的羥基和羧基。

由圖2可知，12-HSA、硬脂醇及硬脂酸對油脂均表現(xiàn)出促氧化作用，而十八烷油脂的頂空耗氧量與空白組無明顯差異。表明羥基及羧基的存在均能促進油脂的氧化，且羥基與羧基單獨作用下的促氧化作用要強于同時含有羥基與羧基的12-HSA。從官能團上看，硬脂醇的羥基和硬脂酸的羧酸均為疏油性基團，分子結(jié)構(gòu)中端基的疏油基團與它們的親油性烴尾組合，能增強分子的空氣-油界面濃縮效應，并且因在空氣-油界面聚集而加速氧的擴散速率[25]，同時吸引促進氧化的過渡金屬[26]。另外，由于硬脂酸的親水親油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值大于硬脂醇，高HLB值具有更大的疏油性，導致硬脂酸更易向空氣-油界面移動，通過其氫鍵作用使羧基相互靠近，界面排列更加緊密，因此比硬脂醇更易降低界面的表面張力并增加溶氧量[16]，導致其促進油脂氧化的效果更加明顯。但是，12-HSA雖然同時具有羥基和羧基，其促氧化能力卻不如硬脂酸和硬脂醇，這暗示羥基和羧基的位置對促氧化作用有較大影響。已有研究表明，線性的脂肪酸更容易進入空氣-油脂界面[27]，和硬脂酸及硬脂醇的線性結(jié)構(gòu)相比，12-HSA由于12位羥基的存在減弱了其分子結(jié)構(gòu)的線性特征，同時，碳鏈中部的羥基通過相互作用形成的分子間氫鍵，不僅增加了分子聚集體積，而且使其在油相中的移動速率低于硬脂酸和硬脂醇；此外，氫鍵導致頭端羧基的遠離使12-HSA無法像硬脂酸和硬脂醇一樣在空氣-油脂界面緊密排列，溶氧能力降低；因此12-HSA促氧化作用弱于硬脂酸和硬脂醇。

圖2 不同添加量的十八烷、12-HSA、硬脂醇和硬脂酸油脂產(chǎn)品在45 ℃下氧化5 d的頂空耗氧量Fig.2 Headspace oxygen consumption for different additions of octadecane, 12-HSA, stearyl alcohol and stearic acid oil products oxidized at 45 ℃ for 5 d

2.3 凝膠結(jié)構(gòu)對12-HSA凝膠化油脂氧化狀態(tài)的影響

室溫25 ℃儲藏條件下，12-HSA凝膠化油脂的流變學特性和微觀結(jié)構(gòu)如圖3所示。當儲能模量與振蕩頻率表現(xiàn)出無關(guān)性時，表明流體已經(jīng)形成了穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[28]。由圖3A可知，添加量1%的12-HSA凝膠化油脂在10－1～100Hz和10 Hz處的儲能模量均表現(xiàn)出頻率相關(guān)性，說明其并未形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。添加量2%以上的12-HSA凝膠化油脂的儲能模量均表現(xiàn)出頻率無關(guān)性，表明已經(jīng)形成了穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。同時，圖3B為25 ℃時偏振光顯微鏡觀察的添加量2% 12-HSA凝膠化油脂的纖維狀晶體結(jié)構(gòu)，顯示出其良好的束縛液態(tài)油脂的特性。結(jié)合圖4的頂空耗氧量測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同添加量的12-HSA凝膠化油脂頂空耗氧量均顯著高于空白組，但是12-HSA添加量2%～5%的凝膠化油脂頂空耗氧量無顯著差異，這和圖3的流變學性質(zhì)具有一致性，說明此時形成的穩(wěn)定凝膠化油脂網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)抑制了分子流動性[29]，使凝膠內(nèi)部形成致密的保護膜，阻礙氧氣進入油相體系引發(fā)氧化。

圖3 室溫下12-HSA凝膠化油脂的流變學特性及微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Rheological properties and microstructure of 12-HSA-containing oleogels at room temperature

圖4 不同添加量的12-HSA凝膠化油脂在25 ℃儲存15 d后的頂空耗氧量Fig.4 Headspace oxygen consumption for oleogels with different additions of 12-HSA oxidized at 25 ℃ for 15 d

凝膠化油脂在不同的食品加工條件下需要經(jīng)歷不同的加熱狀態(tài)，加工溫度會影響12-HSA凝膠化油脂的氧化程度。差示掃描量熱儀分析結(jié)果顯示，12-HSA的熔融溫度為60.23 ℃。添加量2%的12-HSA凝膠化油脂熱力學曲線如圖5所示，49.56 ℃時12-HSA凝膠化油脂出現(xiàn)第一個吸熱峰，此時油脂開始熔化；60 ℃時出現(xiàn)12-HSA的吸熱峰，兩處峰圖重疊形成一個寬的熔融峰，表示凝膠結(jié)構(gòu)逐漸被破壞。由圖6可知，添加量2%的12-HSA凝膠化油脂與空白大豆基料油的氧化程度均隨溫度的升高而增大；當溫度低于60 ℃時，12-HSA凝膠化油脂的氧化程度略低于大豆基料油，此時12-HSA凝膠化油脂仍處于凝膠狀態(tài)，較低溫度的短時間內(nèi)凝膠網(wǎng)絡能減緩油脂氧化；當溫度大于60 ℃時，12-HSA凝膠化油脂的凝膠結(jié)構(gòu)雖然開始被破壞，但由于12-HSA凝膠體系的黏度仍較大，分子向空氣-油脂界面的移動受到限制[29]，促氧化作用不明顯；當溫度達到90 ℃時，12-HSA凝膠化油脂的頂空耗氧量相比空白大豆基料油增加了0.65%；隨著溫度繼續(xù)上升，12-HSA油脂凝膠結(jié)構(gòu)完全被破壞，樣品黏度隨溫度的升高而降低[30]，導致氧化速率加快、促氧化作用明顯；120 ℃時12-HSA凝膠化油脂的頂空耗氧量相比空白組增加了1.78%；隨后頂空耗氧量急劇增加，150 ℃時12-HSA凝膠化油脂的頂空耗氧量比空白對照組增加了6.8%。以上結(jié)果提示，12-HSA凝膠化油脂食品的加工溫度應盡量避免高于90 ℃，且120 ℃以上的高溫將促使產(chǎn)品急劇氧化。

圖5 添加量2%的12-HSA凝膠化大豆油脂熱力學曲線Fig.5 Thermodynamic curve of 2% 12-HSA-containing oleogels

圖6 添加量2%的12-HSA凝膠化大豆油脂在不同溫度下氧化2 h后的頂空耗氧量Fig.6 Headspace oxygen consumption for 2% 12-HSA-containing oleogels oxidized at different temperatures for 2 h

2.4 12-HSA凝膠化油脂熱氧化后的1H-NMR分析結(jié)果

將添加量2%的12-HSA凝膠化油脂置于70 ℃下35 d進行加速氧化實驗，并根據(jù)油脂中H質(zhì)子1H-NMR分析結(jié)果反映油脂的熱氧化狀態(tài)。如圖7A所示，δ7.26處為氘代氯仿的溶劑峰，未經(jīng)熱氧化的12-HSA凝膠化油脂的1H-NMR圖譜在δ0～5.5范圍內(nèi)出現(xiàn)9 個信號峰[31]，這些信號峰主要由油脂中甘油三酯的不同結(jié)構(gòu)中H質(zhì)子產(chǎn)生。圖7B、C分別為12-HSA凝膠化油脂在熱氧化過程中形成氫過氧化物及共軛烯等初級氧化產(chǎn)物（δ5.7～6.7）和形成醛類物質(zhì)等次級氧化產(chǎn)物（δ9.5～9.8）的1H-NMR譜圖[32-33]。數(shù)據(jù)顯示，12-HSA凝膠化油脂在70 ℃下，隨著時間延長，初級氧化產(chǎn)物和次級氧化產(chǎn)物的量均逐漸增加，其中峰4（與過氧化氫基團雙鍵相關(guān)的質(zhì)子）、峰5（順,反-共軛二烯）、峰6（反,反-共軛二烯）和峰9（n-烷醛）信號增強明顯。

圖7 2% 12-HSA凝膠化油脂氧化的1H-NMR譜圖Fig.7 1H-NMR spectra of oxidized 2% 12-HSA-containing oleogels

Rao為脂肪族質(zhì)子（δ0.6～2.5）與烯質(zhì)子（δ5.1～5.4）的峰面積積分的比值，Rad為脂肪族質(zhì)子（δ0.6～2.5）與二烯丙基亞甲基質(zhì)子（δ2.6～2.9）的峰面積積分的比值[18]。隨著12-HSA凝膠化油脂熱氧化的加劇，Rao及Rad均有所增加。這是因為在12-HSA凝膠化油脂在氧化過程中，二烯丙基會被自由基攻擊，且烯族類發(fā)生分子內(nèi)重排，因此二烯丙基、烯族類（不飽和雙鍵）的信號峰出現(xiàn)不同程度的降低，飽和脂肪族上質(zhì)子信號峰則相應增加，這些底物信號峰的變化隨著油脂氧化程度的增加而加劇。如圖8所示，Rao、Rad與TOTOX相關(guān)性較高，其中圖8A的斜率大于圖8B的斜率，表明烯族（一個雙鍵）質(zhì)子到脂肪族質(zhì)子的相對轉(zhuǎn)化速率要慢于二烯丙基（兩個雙鍵）質(zhì)子。高場NMR分析為凝膠化油脂提供了一種快速、無損氧化穩(wěn)定性評估方法。

圖8 添加量2%的12-HSA凝膠化油脂在70 ℃儲藏過程中的TOTOX和Rao、Rad相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between total oxidation value of 2%12-HSA-containing oleogels stored at 70 ℃ and their Rao and Rad

3 結(jié) 論

本實驗研究了12-HSA凝膠劑對凝膠化大豆油氧化的影響。結(jié)果表明，在傳統(tǒng)氧化指標測定中，12-HSA凝膠劑能與酸價測定中的KOH滴定液反應，油脂中游離脂肪酸的真實酸價應為含有12-HSA油脂的實測酸價減去因12-HSA消耗KOH所產(chǎn)生的酸價；12-HSA的促氧化能力低于硬脂醇及硬脂酸；添加量2% 12-HSA凝膠化油脂的穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)能減緩氧化反應；當凝膠結(jié)構(gòu)在高溫下被破壞時，體系向促氧化方向進行并在溫度高于120 ℃時促氧化作用明顯加速；1H-NMR圖譜顯示，12-HSA凝膠化油脂的初級氧化產(chǎn)物和次級氧化產(chǎn)物分別集中在化學位移δ5.7～6.7及δ9.5～9.8處，信號峰強度均隨貯藏時間延長而不斷增強，并且1H-NMR的Rao和Rad與TOTOX相關(guān)性較好。