陳 沖，趙謀明，孫為正

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

活性氧是誘導細胞損傷并最終導致衰老和一系列人類疾?。ㄈ缪装Y、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和癌癥等）的關(guān)鍵因素[1-3]。多肽作為一種新型來源的天然抗氧化劑已受到廣泛關(guān)注，它們在各種基于單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)或氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的抗氧化活性檢測方法中顯示出優(yōu)異的功能活性，如自由基清除能力、過渡金屬離子螯合能力、還原能力以及脂質(zhì)氧化抑制能力等。研究表明，分子質(zhì)量低于3 kDa的小肽通常具有更高的抗氧化活性[4]，包括一些天然生物活性肽，如谷胱甘肽[5]、肌肽[6]、高肌肽和鵝肌肽等。氧化應(yīng)激誘導的氧化或硝化反應(yīng)通常以酪氨酸殘基作為主要攻擊目標，它在自由基清除、脂質(zhì)過氧化抑制以及細胞保護等方面也發(fā)揮著重要作用[7]。自由基介導的酪氨酸殘基硝化反應(yīng)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、硝化機理以及酪氨酸殘基周圍的環(huán)境密切相關(guān)，靠近酪氨酸殘基的氨基酸類型（是否產(chǎn)生氫鍵及攜帶電荷等）會顯著影響其硝化作用[8]。一些來源于動物或植物蛋白質(zhì)的含酪氨酸二肽（如酪氨酸-酪氨酸、酪氨酸-亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸和酪氨酸-賴氨酸等），因其具有顯著的抗氧化活性而備受關(guān)注[9-11]。

多肽抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系一直是該領(lǐng)域的研究熱點[12]，目前已知多肽肽鏈的長短[13]、空間構(gòu)象[14]以及特定的氨基酸（如疏水性氨基酸、帶電荷氨基酸和芳香族氨基酸等）組成[15]、特定氨基酸殘基的位置[16]等都能影響多肽的抗氧化活性。多種化學或生物學相關(guān)的體外實驗被用于評估多肽的抗氧化活性，涉及到包括均相溶液、雙層磷脂、脂質(zhì)體、水膠束分散體等體系，所測得的抗氧化活性會隨所用體系不同而發(fā)生變化[16-18]。多肽在非均相體系中的抗氧化作用機制可能涉及到與均相體系不同的化學和/或物理途徑，還會受到其他因素（如多肽在體系中的分布、定位、取向和遷移）和體系自身穩(wěn)定性的影響[17,19]。綜上所述，為了能更好地運用抗氧化肽這一潛在抗氧化劑資源，對于其在復(fù)雜體系中的抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系及其在均相與非均相體系中的活性差異研究顯得十分重要。

本研究選擇了5 種結(jié)構(gòu)相似的含酪氨酸二肽（酪氨酸-酪氨酸（Tyr-Tyr）、酪氨酸-苯丙氨酸（Tyr-Phe）、苯丙氨酸-酪氨酸（Phe-Tyr）、酪氨酸-丙氨酸（Tyr-Ala）和酪氨酸-絲氨酸（Tyr-Ser）），探究其在脂質(zhì)體體系中的抗氧化活性與其自身結(jié)構(gòu)特性的聯(lián)系，及其在脂質(zhì)體中的抗氧化活性與在水溶液中的還原能力的差異與聯(lián)系，以加深對小肽在非均相體系中抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)相關(guān)性的理解，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

合成二肽Tyr-Tyr、Tyr-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Ala和Tyr-Ser（純度均高于95%） 南京杰肽生物科技有限公司；L-α-磷脂酰膽堿（L-α-phosphatidylcholine，PC）、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）、L-酪氨酸、L-抗壞血酸（VC）、(+)-α-生育酚（VE）、L-還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和L-肌肽美國Sigma-Aldrich公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TLE204電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；CHI 660E電化學工作站 中國上海辰華儀器有限公司；Varioskan多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外吸收光譜的測定

用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）分別將含酪氨酸二肽配制為一系列濃度標準溶液，在200～340 nm波段范圍內(nèi)以1 nm采樣間距進行紫外吸收光譜掃描并記錄其吸收光譜。

1.3.2 還原力的測定

還原力測定參考Oyaizu[20]的方法并作適當修改。取2 mL各樣品（酪氨酸、含酪氨酸二肽和陽性對照（GSH和L-肌肽））的溶液（2 mmol/L）分別加入PBS（0.2 mol/L、pH 6.6）2 mL混勻，再加入2 mL鐵氰化鉀溶液（2 g/100 mL），混勻后50 ℃保溫20 min。然后快速冷卻，加入2 mL三氯乙酸溶液（10 g/100 mL），混勻后4 ℃下以3 000 r/min離心10 min。取離心后上清液2 mL加入2 mL超純水和0.4 mL三氯化鐵溶液（0.1 g/100 mL），混勻后室溫靜置10 min，于700 nm波長處測定吸光度（A700nm）。相同條件下以PBS代替樣品進行反應(yīng)作為空白組，并將其結(jié)果作為背景扣除。

1.3.3 循環(huán)伏安特性的測定

采用循環(huán)伏安特性表征酪氨酸和含酪氨酸二肽的電化學行為，具體操作參考Yang Gang等[21]的方法。使用CHI 660E電化學工作站的三電極體系，以鉑電極和飽和甘汞電極（saturated calomel electrode，SCE）為參比電極，以玻碳電極（直徑3.0 mm）為工作電極。所有被測樣品（1 mmol/L）用PBS（0.1 mol/L、pH 7.0）現(xiàn)用現(xiàn)配，并在進行循環(huán)伏安法分析之前用高純度氮氣處理15 min以除去溶解在這些樣品中的氧氣。分別用新拋光的玻碳電極以10 mV/s的速率掃描，收集樣品在0.25～0.85 V vs.SCE（相對于SCE的電極電位）之間的循環(huán)伏安圖。

1.3.4 脂質(zhì)體模型體系中抗氧化活性的測定

根據(jù)Roberts等[22]的方法制備脂質(zhì)體模型。將10 mL含有3 μmol PC的氯仿溶液與5 mL無水乙醇加入50 mL圓底燒瓶中，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30 ℃下減壓除去溶劑。用氮氣除去殘留在燒瓶壁磷脂薄膜上的溶劑后，加入20 mL PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）進行超聲水合，然后將所得混合物過聚醚砜濾膜（孔徑0.22 μm）3 次，得到單層脂質(zhì)體懸浮液。含有受試物的脂質(zhì)體通過將水合所用PBS替換成一定濃度的（水溶性）樣品（包括含酪氨酸二肽、VC和GSH）溶液或在水合前將（脂溶性）樣品（即VE）溶于無水乙醇而制得。以含有一系列濃度的VC、VE和GSH溶液的脂質(zhì)體作為陽性對照組，不含任何抗氧化劑的單層脂質(zhì)體懸浮液作為空白組。

脂質(zhì)氧化通過水溶性自由基引發(fā)劑AAPH熱解產(chǎn)生的自由基進行誘導[19]。分別取2.5 mL脂質(zhì)體懸浮液加入AAPH溶液（20 μL、終濃度750 μmol/L）后混勻，在37 ℃下孵育200 min，用酶標儀每5 min監(jiān)測234 nm波長處的吸光度（A234nm）變化。脂質(zhì)氧化抑制率按下式計算。

式中：AUC為含受試物脂質(zhì)體的吸光度-時間曲線下面積；AUC0為空白脂質(zhì)體的吸光度-時間曲線下面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值或平均值±標準差的形式表示。采用SPSS 24.0軟件中的方差分析法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著；并采用Pearson相關(guān)系數(shù)法對含酪氨酸二肽抗氧化結(jié)果進行相關(guān)性分析，以P＜0.05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含酪氨酸二肽的紫外吸收特征分析結(jié)果

采用紫外分光光度計對含酪氨酸二肽進行了紫外吸收波段掃描，并以酪氨酸作為對照，結(jié)果如圖1所示。以0.01 mol/L、pH 7.4 PBS作為溶劑的Tyr-Tyr在約224 nm波長處有較強吸收峰，在約275 nm波長處有較弱吸收峰（在約281 nm波長處有一個肩峰），其特征吸收曲線分別為y＝0.010 1x+0.018 4（λmax＝224 nm，R2＝0.999）和y＝0.001 7x+0.001 1（λmax＝275 nm，R2＝0.999）。酪氨酸中酚羥基的存在可產(chǎn)生n→σ*躍遷，從而表現(xiàn)為在224 nm波長處出現(xiàn)強吸收；275 nm波長處的吸收則主要歸因于其苯酚取代基及羰基所產(chǎn)生的π→π*躍遷及n→π*躍遷。除Tyr-Phe與Phe-Tyr（圖1B、C）兩者形狀特征相似以外，酪氨酸及其余二肽的紫外吸收曲線與Tyr-Tyr相比形狀特征相似，而在吸收峰的強度上有些許不同（圖1F）：Tyr-Tyr在約224 nm波長處的吸收峰強度明顯高于酪氨酸，而Tyr-Ala、Tyr-Ser中丙氨酸及絲氨酸的存在對于其分子內(nèi)酚羥基在此處的吸收強度有明顯的降低作用。Tyr-Phe在220 nm波長處附近不再出現(xiàn)明顯吸收峰，且在270 nm波長處附近的吸收峰曲線出現(xiàn)輕微波動（圖1B）。主要是由于苯丙氨酸中苯環(huán)取代基的存在，其產(chǎn)生的π→π*躍遷在200 nm波長處附近出現(xiàn)較強吸收從而使得224 nm波長處附近的吸收峰不再明顯，270 nm波長處附近也傾向于出現(xiàn)苯環(huán)的精細結(jié)構(gòu)；且苯丙氨酸在酪氨酸的C端或N端連接對其吸收強度有顯著影響。由此可見，構(gòu)成5 種含酪氨酸二肽的氨基酸組成、排列順序的差異導致其紫外吸收特征差異明顯。

圖1 酪氨酸和含酪氨酸二肽的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of Tyr and Tyr-containing dipeptides

2.2 含酪氨酸二肽的抗氧化活性分析結(jié)果

2.2.1 還原力法分析結(jié)果

還原力是基于單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)測定的抗氧化活性[23]，能夠反映受試物的供電子能力。以兩種常見抗氧化肽GSH和L-肌肽作為陽性對照，對比分析酪氨酸及含酪氨酸二肽的還原力，結(jié)果如圖2所示。除GSH外，二肽中Tyr-Tyr表現(xiàn)出最高的還原力（A700nm＝0.149 0），其次是Phe-Tyr（A700nm＝0.104 9），而酪氨酸和其余二肽以及L-肌肽還原力較低。有研究也發(fā)現(xiàn)含半胱氨酸殘基的二肽能夠表現(xiàn)出高還原力，而不含半胱氨酸殘基的二肽還原力極低[16]。GSH中的半胱氨酸殘基所含巰基具有獨特的氧化還原及親核特性，L-肌肽的抗氧化活性主要源于其所含咪唑環(huán)[6]，而酪氨酸中酚羥基則是其活性的主要來源。由于還原力反映了抗氧化劑提供電子的能力，因此Tyr-Tyr（含有兩個酚羥基）表現(xiàn)出比其他含酪氨酸二肽更高的活性。肽鍵和C/N端帶電荷基團（氨基/羧基）可能參與氧化還原途徑[23]，因此，其余二肽顯示出不同的還原力，特別是Tyr-Phe和Phe-Tyr，兩者雖組成相同，但還原力差異顯著（P＜0.05）。而結(jié)構(gòu)更相似的Tyr-Phe、Tyr-Ala和Tyr-Ser三者之間還原力沒有顯著性差異。

圖2 酪氨酸和含酪氨酸二肽（2 mmol/L）的還原力Fig.2 Reducing power of Tyr and Tyr-containing dipeptides at a concentration of 2 mmol/L

2.2.2 循環(huán)伏安法分析結(jié)果

電化學法可用于測定總還原力，特別是針對低分子質(zhì)量的抗氧化劑，該方法已廣泛運用于食品及飲料的抗氧化能力檢測[24]。某些氨基酸或其衍生物（如酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等）的抗氧化性可以通過電化學法測定。它們都是電化學活性化合物，電化學活性肽或蛋白質(zhì)的伏安特性即來源于氨基酸序列中的這些活性殘基[25]。本研究以0.1 mol/L、pH 7.0的PBS作為溶劑，測得受試樣品的循環(huán)伏安圖如圖3所示。樣品均顯示出不可逆氧化的單個陽極峰，而沒有陰極峰，表明所有的氧化產(chǎn)物都沒有在玻碳電極表面還原，因此，定量分析數(shù)據(jù)僅由陽極峰確定。

圖3 酪氨酸和含酪氨酸二肽（1 mmol/L）的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of Tyr and Tyr-containing dipeptides at a concentration of 1 mmol/L

表1列出了從循環(huán)伏安圖（圖3）中提取出的關(guān)鍵電化學參數(shù)，其中氧化電位可用于識別抗氧化劑的類型，而氧化電流則與抗氧化劑的濃度成正比[21]。通常，更低的氧化電位表明化合物具有更高的供電子能力，即更高的抗氧化能力[26]。半波電位通常用于估算物質(zhì)的標準電化學電位，比氧化電位更準確。本研究中的電化學參數(shù)描述了氧化過程，并將樣品表征為還原劑。酪氨酸的氧化電流（10.937 μA）最高，表明酪氨酸與玻碳電極表面之間具有最大的電子轉(zhuǎn)移速率，可能與其分子大小及空間位阻有關(guān)[27]。受試樣品的半波電位分布在相對較窄的范圍內(nèi)（0.510～0.576 V vs.SCE）。其中，Tyr-Tyr的半波電位（0.510 V vs.SCE）最低，即抗氧化性最強，其他樣品的半波電位則按Phe-Tyr＜Tyr＜Tyr-X（Tyr-Ser、Tyr-Phe和Tyr-Ala）的升序（P＜0.05）排列。如表2所示，該結(jié)果與還原力法的結(jié)果具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），可以認為含酪氨酸二肽的氨基酸骨架和靜電性質(zhì)可能影響酪氨酸殘基酚羥基的氧化還原特性[28]，從而導致二肽顯示出不同的還原能力。

表1 循環(huán)伏安圖（圖3）中提取出的電化學參數(shù)Table 1 Electrochemical parameters extracted from cyclic voltammograms shown in Fig.3

表2 含酪氨酸二肽在脂質(zhì)體與均相體系中的抗氧化活性相關(guān)性Table 2 Correlation between antioxidant activity of Tyr-containing dipeptides determined in liposomal system and that in aqueous system

2.2.3 脂質(zhì)體體系中的抗氧化活性分析結(jié)果

由于脂-水界面的存在，使得脂質(zhì)體體系中的脂質(zhì)氧化較均相體系更為復(fù)雜，脂質(zhì)體的特性、脂質(zhì)氧化的起始位置、自由基和抗氧化劑的分布及其與脂質(zhì)體的相互作用均會對脂質(zhì)氧化過程產(chǎn)生不同程度的影響[19]。本實驗首先研究了不同濃度的VC、VE和GSH在AAPH誘導氧化脂質(zhì)體體系中對脂質(zhì)氧化的影響。脂質(zhì)體樣品在234 nm波長處的吸光度能夠反映脂質(zhì)氧化初級產(chǎn)物共軛二烯[19]的含量，脂質(zhì)氧化抑制率經(jīng)計算后在表3中列出。從空白組的脂質(zhì)氧化曲線來看（圖4），AAPH誘導脂質(zhì)氧化能在約75～175 min內(nèi)迅速生成共軛二烯，隨后其生成速率變緩并在200 min左右達到最大值；1.5 μmol/L的抗氧化劑已能顯著抑制脂質(zhì)氧化（抑制率以VC＜GSH＜VE的升序顯著遞增（P＜0.05））。此外，在本實驗濃度范圍內(nèi)，3 種抗氧化劑對于脂質(zhì)氧化的抑制率與其濃度之間呈現(xiàn)出不同規(guī)律的劑量依賴關(guān)系：VC對于脂質(zhì)氧化的抑制率隨濃度增加呈線性增長趨勢（y＝0.020 4x+0.165 8，R2＝0.975）；GSH的抑制率隨濃度增加呈對數(shù)型增長趨勢（y＝0.227lnx+0.231 3，R2＝0.937），其濃度達到15 μmol/L之后抑制率增加不再顯著；VE的抑制率隨濃度增加也呈對數(shù)型增長趨勢（y＝0.104 2lnx+0.595 5，R2＝0.845），但其濃度在達到7.5 μmol/L之后抑制率增加不再顯著?？偟貋碚f，相同濃度下VC的抑制率始終顯著低于VE和GSH（P＜0.05）；在低濃度（＜15 μmol/L）下VE的抑制率顯著高于GSH（P＜0.05），而隨著濃度進一步增加，兩者之間無顯著性差異。

圖4 含酪氨酸二肽對AAPH誘導脂質(zhì)體氧化體系中脂質(zhì)氧化的影響Fig.4 Effect of Tyr-containing dipeptides on AAPH-induced lipid oxidation in liposomal system

AAPH熱解所產(chǎn)生的自由基極性較低，能夠在磷脂雙層膜內(nèi)自由分配和擴散，因此AAPH自由基在雙層膜內(nèi)大量集中并在此誘導脂質(zhì)氧化鏈式反應(yīng)，從而能在短時間內(nèi)即導致脂質(zhì)體體系的劇烈氧化[19]。由于VE具有親脂性，在雙層膜內(nèi)部疏水區(qū)域分布更為廣泛，因此對于脂質(zhì)氧化的抑制效果最為明顯。而GSH具有兩親性，傾向于從水相擴散并吸附至脂-水界面，一方面可以直接清除脂質(zhì)氧化自由基，阻斷鏈式反應(yīng)，從而對磷脂起到良好的保護作用；另一方面，由于GSH含有帶電基團，能與磷脂頭部的PO2－及N+(CH3)3發(fā)生靜電相互作用[29]，從而改變磷脂膜的結(jié)構(gòu)，進一步影響其自身的脂質(zhì)氧化抑制效果。

在AAPH誘導氧化脂質(zhì)體體系中，對7.5 μmol/L含酪氨酸二肽的脂質(zhì)氧化抑制率進行了檢測。結(jié)果如圖4A及表3所示，二肽的抗氧化活性按Tyr-Tyr＞Phe-Tyr＞Tyr-Phe＞Tyr-Ala＞Tyr-Ser的降序排列，但在此濃度下其抑制率均明顯低于VC、VE和GSH。對一系列濃度Tyr-Tyr的檢測結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，Tyr-Tyr對于脂質(zhì)氧化的抑制率隨濃度增加也呈現(xiàn)出線性增長趨勢（y＝0.012 9x+0.020 3，R2＝0.975），但與VC相比抑制率隨濃度增加的速率更低。如表2所示，含酪氨酸二肽在脂質(zhì)體體系中的抗氧化活性結(jié)果與還原力法及循環(huán)伏安法所得結(jié)果均具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），說明在這幾種抗氧化活性測定方法中，酚羥基作為電子供體參與了體系中的氧化還原反應(yīng)，二肽在脂質(zhì)體中的抗氧化活性與其供電子能力顯著相關(guān)。有研究指出，在脂質(zhì)體體系中抗氧化劑的活性不僅受其自身特性（如氧化還原能力、親脂/水性）的影響，還與脂-水界面的性質(zhì)（如電荷分布、脂質(zhì)膜剛度）及其在脂-水界面上的分布和相互作用有關(guān)[17]。由VC、VE和GSH的抗氧化分析結(jié)果可知，抗氧化劑的親脂/水性確實會對其在脂質(zhì)體體系中的抗氧化活性產(chǎn)生影響。作為兩親性化合物，二肽的脂水分配系數(shù)可通過計算得出介于－3.25～－0.81之間，親脂性按照Tyr-Phe＝Phe-Tyr＞Tyr-Tyr＞Tyr-Ala＞Tyr-Ser的降序排列[30]。綜合以上結(jié)果分析，Tyr-Tyr的脂質(zhì)氧化抑制率最高，可能是由于其分子內(nèi)所含酚羥基數(shù)量占優(yōu)勢。Tyr-Phe與Phe-Tyr的氨基酸組成及親脂性一致，然而抑制率及其在還原力法、循環(huán)伏安法中所得結(jié)果都有明顯差異，說明苯丙氨酸連接在酪氨酸的C端或N端可能對于酪氨酸中酚羥基的供電子能力具有明顯影響。Tyr-Ala及Tyr-Ser的親脂性更低，可能是造成其在脂質(zhì)體體系中抑制率降低的主要原因。此外，5 種二肽與磷脂膜的相互作用對于膜結(jié)構(gòu)的影響及其與抑制率的關(guān)系已在前期研究[30]中探討。

表3 樣品在AAPH誘導脂質(zhì)體氧化體系中的脂質(zhì)氧化抑制率Table 3 Percentage inhibition of lipid oxidation by dipeptides and other antioxidants in AAPH-induced liposomal system

3 結(jié) 論

利用紫外分光光度計對5 種含酪氨酸二肽的紫外吸收特征光譜進行了檢測，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成含酪氨酸二肽的氨基酸組成及排列順序會導致其吸收特征的顯著差異。利用還原力法及循環(huán)伏安法檢測了含酪氨酸二肽的供電子能力，發(fā)現(xiàn)酚羥基的數(shù)量起決定性作用，其余氨基酸的種類以及在C/N端的分布對于酚羥基的供電子能力影響顯著。在AAPH誘導氧化脂質(zhì)體體系中，以VC、VE及GSH為對照對比分析了含酪氨酸二肽的脂質(zhì)氧化抑制率，結(jié)果表明含酪氨酸二肽的抗氧化活性除了與其供電子能力顯著相關(guān)外，還與其自身的親脂/水性具有一定的相關(guān)性。本研究揭示了含酪氨酸二肽在脂質(zhì)體體系中的活性與其自身特性的關(guān)系，可為其在復(fù)雜食品體系實際生產(chǎn)中的進一步應(yīng)用提供指導。