劉國(guó)艷,李思童,梁 麗,朱雯綺,周婉麗,徐 鑫
(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)
油茶籽油被譽(yù)為“東方橄欖油”與“食用油之王”,含有多種脂質(zhì)伴隨物,其中酚類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化能力,是油茶籽油重要的活性成分[1-2]。天然存在的酚類化合物根據(jù)其與基質(zhì)中其他物質(zhì)結(jié)合與否分為游離酚(free phenolics,F(xiàn)P)與結(jié)合酚(bound phenolics,BP),而結(jié)合酚又因其結(jié)合對(duì)象或價(jià)鍵不同分為酯化酚(esterified phenolics,EP)及不溶性結(jié)合酚(insoluble-bound phenolics,ISP),其中EP又稱為可溶性結(jié)合酚[3-4]。研究表明,酚類化合物的形態(tài)與其抗氧化活性相關(guān),然而這些研究大多集中于果蔬及谷物,在油脂體系中研究較少[5-6]。Wang Yukun等[7]研究發(fā)現(xiàn)豆類BP的抗氧化能力強(qiáng)于FP,但不同種類大豆中ISP與EP的物質(zhì)組成不同導(dǎo)致其抗氧化能力存在差異;裘芳成等[8]研究發(fā)現(xiàn)山茶油中糖苷態(tài)酚類化合物抗氧化能力最強(qiáng),其次為ISP、EP及FP;Thiyam等[9]研究表明油菜籽中芥子酸及FP表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用,BP與總酚則因芥子堿的存在表現(xiàn)出一定的促氧化作用;Alu'datt等[10]利用亞油酸氧化法研究橄欖油中酚類化合物的抗氧化活性,結(jié)果表明相較于BP,F(xiàn)P抗氧化活性更強(qiáng)?,F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),不同原料中酚類化合物形態(tài)與抗氧化活性相關(guān)性不一致,因此有必要對(duì)油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力進(jìn)行研究。
油脂的氧化穩(wěn)定性是多種天然抗氧化成分共同作用的結(jié)果,而抗氧化成分之間常存在相加、協(xié)同及拮抗等互作關(guān)系[11]。油茶籽油中發(fā)揮重要抗氧化作用的酚類化合物種類多樣,如Wang Xiaoqin等[12]在油茶籽油中鑒定出24 種酚類化合物,其間存在的抗氧化互作關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,因此基于酚類化合物單體研究其互作關(guān)系難度較大。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)油茶籽油酚類化合物進(jìn)行形態(tài)區(qū)分,在不同形態(tài)下對(duì)其抗氧化互作關(guān)系進(jìn)行初步研究。
本實(shí)驗(yàn)以油茶籽油為研究對(duì)象,分析其中FP、EP及ISP的含量及主要物質(zhì)組成,并測(cè)定鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power,F(xiàn)RAP)、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid),ABTS)陽(yáng)離子自由基清除能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力,對(duì)比不同形態(tài)酚類化合物單獨(dú)作用及混合作用下的抗氧化效果,初步探究其互作關(guān)系類型,為闡明脂質(zhì)伴隨物中酚類物質(zhì)的抗氧化機(jī)理提供參考。
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甲醇、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、福林酚、過(guò)硫酸鉀、氯化鐵、氯仿、吐溫20、醋酸鈉、冰乙酸、DPPH、ABTS、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TPTZ)、β-胡蘿卜素、亞油酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;沒(méi)食子酸阿拉丁試劑有限公司;乙腈、超純水 默克化工技術(shù)有限公司;甲酸 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;2-氯苯丙氨酸 吉爾生化有限公司。
PHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;DF-15連續(xù)投料粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;QYZ-230型自動(dòng)液壓榨油機(jī) 山東省泰安市良君益友機(jī)械有限公司;SHJ-A6數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″伾虾1壤蕛x器有限公司;SHB-III真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RV-10 basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司;UV1000紫外分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;Acquity UPLC-I級(jí)超高效液相色譜儀、Vevo G2-S質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司。
1.3.1 油茶籽油的制備
采用冷榨法制備油茶籽油。油茶籽脫殼,于60 ℃烘干后粉碎,用榨油布包裹放于榨油機(jī)中常溫加壓壓榨,壓力40~60 MPa,收集油茶籽油,用紗布過(guò)濾除去不溶性雜質(zhì),得到油茶籽油。
1.3.2 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的提取
油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物提取工藝參考Ayouba[13]、Kang[14]等的方法并優(yōu)化后得到。
FP、EP提取及FP提取液制備:稱取5 g油茶籽油按照料液比1∶15(m/V)加入體積分?jǐn)?shù)60%甲醇溶液,45 ℃下提取1.5 h后離心,取甲醇層(上層),重復(fù)提取3 次,合并甲醇層;收集油相(下層)進(jìn)行ISP提取。于40 ℃下將合并的甲醇層真空濃縮至20 mL后用正己烷萃取除去殘余油相,水相按照1∶1體積比添加乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次,合并乙酸乙酯層于40 ℃下真空蒸干得到FP,使用5 mL無(wú)水甲醇溶解以獲得FP甲醇提取液;乙酸乙酯萃取后的水相用于EP甲醇提取液制備。
EP甲醇提取液制備:向上述乙酸乙酯萃取后的水相按照1∶3體積比加入0.25 mol/L NaOH溶液,于45 ℃下避光堿解6 h,所得堿解液調(diào)節(jié)pH值至2后適量濃縮至20 mL,再用正己烷萃取除去殘余油相,水相按照體積比1∶1加入乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次,合并乙酸乙酯層于40 ℃下真空蒸干,使用5 mL無(wú)水甲醇溶解以獲得EP甲醇提取液。
ISP提取及其甲醇提取液制備:向提取FP后的油相中按照料液比1∶3(m/V)加入0.25 mol/L NaOH溶液,于45 ℃下避光堿解6 h后調(diào)節(jié)pH值至2,分離油相和水相,收集水相(下層),并用正己烷萃取除去殘余油相,再按照體積比1∶1加入乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次,合并乙酸乙酯層于40 ℃下真空蒸干,使用5 mL無(wú)水甲醇溶解以獲得ISP甲醇提取液。
FP、EP、ISP甲醇提取液用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。
1.3.3 酚類化合物含量及純度測(cè)定
采用Folin-Ciocalteu法[15]。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.012 1x-0.000 6,R2=0.999;其中y為吸光度,x為酚類化合物質(zhì)量濃度/(mg/mL)。
不同形態(tài)酚類化合物的純度測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]。
1.3.4 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的組成分析
參考文獻(xiàn)[16],使用超高效液相串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜法對(duì)油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物進(jìn)行分析鑒定。
色譜條件:色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:A為0.05%(體積分?jǐn)?shù),后同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫:0.0~1.0 min,95% A;1.0~12.0 min,95% A~5% A;12.0~13.5 min,5% A;13.5~13.6 min,5% A~95% A;13.6~16.0 min,95% A。柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:3 μL;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 ℃。
質(zhì)譜條件:加熱器溫度300 °C;鞘氣流速:45 arb;輔助氣流速:15 arb;尾氣流速:1 arb;電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)電壓:3.0 kV(ESI+)及3.2 kV(ESI-);毛細(xì)管溫度:350 ℃;S-Lens RF Level:30%(ESI+)及60%(ESI-)。掃描模式:一級(jí)全掃描,離子掃描范圍70~1050m/z;數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描(dd-MS2, TopN=10);一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜分辨率分別為70 000與17 500。碰撞模式:高能量碰撞解離。
1.3.5 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力測(cè)定
分別測(cè)定1.3.2節(jié)提取所得不同形態(tài)酚類化合物甲醇提取液的FRAP、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力,并計(jì)算其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(half-maximal inhibitory concentration,IC50),單位為mg/mL。
FRAP測(cè)定:參考王俐娟[17]的方法并加以修改。FRAP試劑配制:將300 mmol/L pH 3.6醋酸緩沖液、20 mmol/L FeCl3、10 mmol/L TPTZ(溶劑為4 mmol/L HCl)按體積比10∶1∶1混合。取上述FRAP試劑2.7 mL與0.3 mL不同質(zhì)量濃度梯度樣品混合均勻,室溫下反應(yīng)8 min后,于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A,用甲醇替代樣品按照相同方法測(cè)定吸光度A0,F(xiàn)RAP按式(1)計(jì)算。
ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定:參考文獻(xiàn)[17]。
DPPH自由基清除能力測(cè)定:參考文獻(xiàn)[18]。
β-胡蘿卜素漂白能力測(cè)定:參考文獻(xiàn)[10]。
1.3.6 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化互作關(guān)系分析
以1.3.2節(jié)提取所得FP、EP、ISP甲醇提取液為對(duì)象,將其兩兩或3 種形態(tài)酚復(fù)配(復(fù)配比(質(zhì)量濃度比)為1∶1或1∶1∶1),測(cè)定其不同質(zhì)量濃度下的抗氧化能力,計(jì)算IC50實(shí)驗(yàn)值,兩兩復(fù)配分別按照公式(2)、(3)計(jì)算復(fù)配的IC50理論值及相互作用指數(shù)(γ)[19],3 種形態(tài)酚復(fù)配分別按照公式(4)、(5)計(jì)算復(fù)配的IC50理論值及γ。采用t檢驗(yàn)對(duì)IC50實(shí)驗(yàn)值與IC50理論值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較,IC50實(shí)驗(yàn)值<IC50理論值,即為協(xié)同作用。γ評(píng)價(jià)協(xié)同作用及拮抗作用的程度,γ=1表示為相加作用;γ<1表示為協(xié)同作用,γ值越小表明協(xié)同作用越強(qiáng);γ>1表示為拮抗作用。
式中,IC50實(shí)驗(yàn)值是根據(jù)酚類化合物在不同質(zhì)量濃度下的抗氧化能力繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算得到,IC50A、IC50B及IC50C為FP、EP和ISP單獨(dú)作用時(shí)的IC50實(shí)驗(yàn)值;IC50Amix、IC50Bmix及IC50Cmix為復(fù)配組中FP、EP和ISP的IC50實(shí)驗(yàn)值,即復(fù)配組實(shí)驗(yàn)下得到IC50實(shí)驗(yàn)值與酚類化合物在復(fù)配組中所占比例的乘積(兩兩復(fù)配與3 種形態(tài)復(fù)配樣中酚類化合物在復(fù)配組中所占比例分別為1/2與1/3)。
實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin軟件繪圖,采用Excel 2016、SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,通過(guò)單因素方差分析Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較(P<0.05)。
對(duì)油茶籽油FP、EP及ISP進(jìn)行提取,有機(jī)溶劑可直接提取的為可溶性酚類化合物(FP及EP),含水有機(jī)溶劑會(huì)破壞酚類化合物分子間的氫鍵,有利于酚類化合物的溶出,故采用體積分?jǐn)?shù)60%甲醇溶液對(duì)可溶性酚類化合物(FP及EP)進(jìn)行提取[18,20]。另外,而ISP的釋放則需要經(jīng)過(guò)酸解或堿解,相較于酸解的高溫條件,堿解條件下酚類化合物損失較小,并且堿解會(huì)破壞酯鍵更有利于釋放出與酯類化合物結(jié)合的酚類化合物,故采用堿解方式對(duì)ISP進(jìn)行提取[21-22]。油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的含量及純度如圖1所示。油茶籽油總酚含量為(137.97±5.14)mg/kg,其中油茶籽油中ISP含量顯著高于FP及EP(P<0.05),約為總酚含量的47.74%;EP含量最低,約為總酚含量的20.78%。ISP的純度顯著低于其他兩種形態(tài)的酚類化合物(P<0.05),EP純度最高。
圖1 油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的含量及其在提取物中的純度Fig.1 Contents of different forms of phenolic compounds in camellia seed oil and purities of phenolic compounds extracted from the oil
表1列出了超高效液相串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜法鑒定所得主要存在于油茶籽油中的12 種酚類化合物,由此可知,不同形態(tài)酚類化合物的主要物質(zhì)組成僅在含量上存在差異。油茶籽油酚類化合物主要以酚酸衍生物存在,約占總酚的82%左右,其余為類黃酮。FP中含量較高為苯甲酸衍生物(主要為異香蘭素及甲基香蘭素),類黃酮中則主要為橙皮苷;EP則以水楊酸含量最高,約占總EP的62%;ISP中3,4-二羥基扁桃酸含量最高,約占總ISP的53%,其次為熊果酸甲酯(約15%)。
表1 油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的主要物質(zhì)組成Table 1 Major components of phenolic compounds in different forms extracted from camellia seed oil
2.2.1 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力
FRAP及ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均基于單電子轉(zhuǎn)移(single electron transfer,SET)機(jī)制,酚類化合物給出電子將氧自由基轉(zhuǎn)化為陰離子,達(dá)到抗氧化作用[14,23]。如圖2A~B所示,各樣品均具有一定的電子轉(zhuǎn)移能力及自由基清除能力,且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。油茶籽油酚類化合物的FRAP及ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力排序分別為:FP>EP>ISP、ISP>FP>EP。SET機(jī)制下物質(zhì)的抗氧化能力取決于其活性基團(tuán)的電離勢(shì),不同形態(tài)酚類化合物的電離勢(shì)存在差異,從而導(dǎo)致酚類化合物抗氧化能力存在差異[18,24]。
DPPH自由基清除能力基于氫原子轉(zhuǎn)移(hydrogen atom transfer,HAT)機(jī)制及SET機(jī)制結(jié)合作用,酚類化合物給出氫原子或電子與氧自由基結(jié)合以清除自由基[25-26]。如圖2C所示,酚類化合物的DPPH自由基清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān),不同形態(tài)酚類化合物DPPH自由基清除能力由高到低排序?yàn)椋篍P>ISP>FP。可能是由于堿解破壞了EP的酯鍵,釋放出與基質(zhì)相結(jié)合的酚類化合物,暴露的羥基更容易與自由基結(jié)合。Wang Yukun[7]、王俐娟[17]等研究表明大豆及茶葉籽油中BP的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于FP,Kaisoon[27]、Chandrasekara[28]等發(fā)現(xiàn)可食用花卉及谷物中ISP的DPPH自由基清除能力顯著低于EP(P<0.05),與本研究結(jié)果相似。
β-胡蘿卜素漂白法通過(guò)測(cè)定亞油酸氧化程度反映待測(cè)物抗氧化活性,因此適于評(píng)價(jià)油脂提取物[29]。如圖2D所示,油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物均具有抑制脂質(zhì)氧化的能力,且與其質(zhì)量濃度相關(guān),其根據(jù)表2中β-胡蘿卜素漂白能力實(shí)驗(yàn)中的IC50實(shí)驗(yàn)值比較β-胡蘿卜素漂白能力,不同形態(tài)酚類化合物的β-胡蘿卜素漂白能力由高到低排序?yàn)椋篍P>ISP>FP,與DPPH自由基清除能力趨勢(shì)相同。但Alu'datt等[10]研究發(fā)現(xiàn),橄欖油中FP的β-胡蘿卜素漂白能力高于BP,與本研究結(jié)果不一致??赡苁情蠙煊秃陀筒枳延椭蟹宇惢衔锝M成也有所區(qū)別,因而其活性基團(tuán)組成及排列不同,影響其抗氧化活性,導(dǎo)致其研究結(jié)果存在一定差異[17,20]。
圖2 不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant activity of extracted phenolic compounds in different forms at different concentrations
2.2.2 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化互作關(guān)系
分析FP、EP及ISP復(fù)配后在不同評(píng)價(jià)方法下的IC50及其相互作用指數(shù),其抗氧化互作關(guān)系如表2所示。FP+ISP組合及EP+ISP組合在不同抗氧化機(jī)制下均表現(xiàn)出一定的相加或協(xié)同作用,且后者的抗氧化活性更強(qiáng),可能是由于兩種組合中的強(qiáng)抗氧化劑相互再生或弱抗氧化劑再生強(qiáng)抗氧化劑,提高了整體的抗氧化強(qiáng)度從而表現(xiàn)出相加或協(xié)同效應(yīng)[11,17]。另一方面,F(xiàn)P+EP組合在ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力測(cè)定方法下,F(xiàn)P+EP+ISP組合在DPPH自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力測(cè)定方法下均表現(xiàn)出明顯的拮抗作用,可能是由于體系中強(qiáng)抗氧化劑也可再生弱抗氧化劑,使整體抗氧化活性降低,產(chǎn)生拮抗效應(yīng)[11,30]。FP+EP組合在FRAP及DPPH自由基清除能力測(cè)定方法下,F(xiàn)P+EP+ISP組合在FRAP及ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定方法下均表現(xiàn)出相加作用。有研究發(fā)現(xiàn),酚類化合物的還原電位越低,其給電子能力越強(qiáng),與過(guò)氧自由基結(jié)合能力就越強(qiáng),因此含較高質(zhì)量濃度低還原電位物質(zhì)的組合表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用[11,23]。此外,油脂中不同形態(tài)酚類化合物的物質(zhì)組成及含量均有區(qū)別,其所包含的活性基團(tuán)存在差異,影響了酚類化合物的氫原子及電子轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致復(fù)配組合在不同機(jī)制下表現(xiàn)出不同的抗氧化互作關(guān)系[5,20]。如,ISP中含量較高的3,4-二羥基扁桃酸、熊果酸甲酯及高車前素分子中,苯鄰位、間位羥基與基質(zhì)結(jié)合形成分子間氫鍵,并降低其酚羥基及碳碳雙鍵的解離能及電離勢(shì),發(fā)揮出更強(qiáng)的抗氧化能力,因此含ISP的兩兩復(fù)配組合主要呈協(xié)同作用。
表2 不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力Table 2 Antioxidant interaction of phenolic compounds in different forms
油脂自動(dòng)氧化過(guò)程中,氫過(guò)氧化物分解形成大量自由基,抗氧化劑提供氫原子與氧自由基結(jié)合形成非自由基產(chǎn)物或更穩(wěn)定的抗氧化劑自由基,終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以達(dá)到延緩脂質(zhì)氧化的作用,這一機(jī)理與酚類化合物在HAT機(jī)制下清除DPPH自由基相似。另外,在SET機(jī)制中發(fā)現(xiàn)酚類化合物具有較強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移能力,表明其具有較低的還原電位及在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中將氫原子提供給過(guò)氧自由基的能力[31]。由此可以推斷酚類化合物可增強(qiáng)油脂穩(wěn)定性,且EP+ISP組合可能發(fā)揮明顯的協(xié)同作用。
本研究以油茶籽油為原料,分析其中FP、EP及ISP的含量及其主要物質(zhì)組成,結(jié)果表明,油茶籽油FP、EP及ISP含量分別為(43.43±2.05)、(28.67±1.51)mg/kg及(65.87±1.34)mg/kg,其中ISP含量顯著高于FP及EP(P<0.05),為油茶籽油總酚的47.74%,而EP含量最低,約為總酚含量的20.78%。另外,F(xiàn)P中以苯甲酸衍生物含量較高(主要為異香蘭素及甲基香蘭素),EP中主要為水楊酸,ISP中主要為3,4-二羥基扁桃酸。通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、FRAP及β-胡蘿卜素漂白能力,對(duì)油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化活性及其互作關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明,不同形態(tài)酚類化合物在不同機(jī)制下的抗氧化能力存在差異。不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化互作關(guān)系結(jié)果顯示,F(xiàn)P+ISP組合及EP+ISP組合在不同抗氧化機(jī)制下均表現(xiàn)出一定的協(xié)同或相加作用,且后者的抗氧化活性更強(qiáng);而FP+EP組合及FP+EP+ISP組合則表現(xiàn)出拮抗或相加作用。本研究揭示了油茶籽油中3 種形態(tài)酚類化合物的互作關(guān)系,有助于闡明脂質(zhì)伴隨物的抗氧化機(jī)理,同時(shí)為具有協(xié)同增效作用酚類化合物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。