劉志敏 趙倩倩 王 傲 喬文竹 宋東輝,2#

(1.天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457；2.天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457)

海底蘊藏著豐富的石油資源，海洋石油開采給社會帶來巨大經(jīng)濟利益的同時也給海洋造成巨大污染，近年來頻發(fā)的海上漏油事故已成為海洋生態(tài)環(huán)境的一大威脅[1-2]。石油的主要成分為烷烴和芳香烴，根據(jù)化學結構，烷烴可以分為支鏈烷烴和直鏈烷烴，而芳香烴是由不同烷基取代的一個或幾個芳環(huán)組成的一類碳氫化合物[3]，常見的芳香烴包括萘、菲、蒽、芘等化合物，化學性質(zhì)十分穩(wěn)定[4-5]。芳香烴類物質(zhì)對人和動物的毒性影響較大，尤其是多環(huán)芳烴[6]，可以通過呼吸、皮膚接觸、飲食攝入等方式進入人或動物體內(nèi)，影響其肝、腎等器官的正常功能，引起癌變[7]。

生物技術是指通過石油烴降解菌來加快石油烴從環(huán)境中的去除，近年來被廣泛應用于石油烴污染環(huán)境的修復過程中[8-11]。與直接投放游離菌劑相比，固定化微生物技術由于具有微生物密度高、反應迅速、微生物流失少等優(yōu)點，成為環(huán)境治理領域的研究熱點[12-14]。微生物固定化是指通過物理或化學手段使游離狀態(tài)的微生物固定在有限的空間，或包埋于高分子材料中，保持生物活性并使之緩慢釋放的生物方法[15]。在微生物的固定化方法中，包埋法[16]是最常見的，具有操作簡單、對微生物活性影響較小等優(yōu)點。結合以往研究，殼聚糖可作為一種輔助的載體，與海藻酸鈉結合形成一種更加緊密的結構來包裹菌體[17-18]。本實驗采用海藻酸鈉與殼聚糖作為包埋載體，對石油烴降解菌Acinetobactersp. Tust-DM21(以下簡稱Tust-DM21)進行固定化，并將固定化小球投放到石油培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并測定石油烴降解率，通過設置不同濃度的海藻酸鈉和殼聚糖的混合膠體來對微生物的固定化條件進行優(yōu)化，考察pH和NaCl濃度對石油烴降解率的影響，為菌株在石油污染修復中的應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及其來源

Acinetobactersp. Tust-DM21菌株為本實驗室前期從渤海灣海洋石油勘探船廢油收集區(qū)中分離得到，存于30%(質(zhì)量分數(shù))甘油中，-80 ℃冷藏。該菌株已被中國海洋微生物菌種保藏管理中心(http://mccc.org.cn/)收藏，菌株編號MCCC 1K03249，其16S rRNA序列在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中的登錄號為KX390866。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g溶于1 000 mL蒸餾水中，pH調(diào)至7，121 ℃下高壓滅菌20 min。

無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.50 g、Na2HPO41.50 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、(NH4)2SO41.00 g、FeSO40.02 g、CaCl20.01 g溶于1 000 mL蒸餾水中，pH調(diào)至7，121 ℃下高壓滅菌20 min。

石油培養(yǎng)基：在無機鹽培養(yǎng)基的基礎上，通過實驗需求改變pH及NaCl濃度，向其中加入0.06 g已滅菌處理的石油原液。

1.1.3 主要溶液

石油原液：取自天津大港油田，為低硫環(huán)烷基類型，密度0.949 g/cm3，石蠟質(zhì)量分數(shù)為5.6%，膠質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為22.0%，不含瀝青質(zhì)。

交聯(lián)劑溶液：稱取CaCl220 g溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備

取適量富集培養(yǎng)后的菌株接入LB培養(yǎng)基中，在適宜溫度下進行培養(yǎng)。取已經(jīng)活化后的培養(yǎng)液600 mL，在5 000 r/min下離心5 min，棄上清液，沉淀全部溶于200 mL LB培養(yǎng)基中，制成菌懸液。

1.2.2 固定化小球制備

稱取4 g海藻酸鈉與1.00 g殼聚糖粉末混勻，加入100 mL蒸餾水制成凝膠。取15 mL凝膠與10 mL菌懸液進行混合，勻速滴至交聯(lián)劑溶液中，4 ℃交聯(lián)24 h制成固定化小球。

1.2.3 單因素影響實驗

固定化小球制備時，為考察海藻酸鈉與殼聚糖對固定化效果的影響，分別調(diào)節(jié)海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)分別為2%、3%、4%、5%、6%(即添加量為2、3、4、5、6 g)，殼聚糖質(zhì)量分數(shù)分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%(即添加量為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g)，其余固定化操作方法同1.2.2節(jié)。參考文獻[19]，對不同條件下制得的固定化小球進行理化性能測定。將固定化小球放入石油培養(yǎng)基中，室溫下?lián)u床培養(yǎng)5 d，測定石油烴降解率。

選擇石油烴降解率最高的固定化小球進行后續(xù)石油烴降解實驗。為考察pH及NaCl對固定化小球降解石油烴的影響，調(diào)節(jié)石油培養(yǎng)基pH分別為6、7、8、9、10，NaCl質(zhì)量分數(shù)分別為2%、3%、4%、5%、6%，相同條件下培養(yǎng)5 d，測定石油烴降解率。

1.2.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選出每個單因素的適宜條件，根據(jù)SPSS 22軟件設計四因素三水平正交實驗方案，正交實驗因素水平設計見表1。

表1 正交實驗因素水平

1.2.5 游離菌劑與固定化小球石油烴降解效果對比

取100 g土壤置于直徑9 cm、高12 cm的花盆中。稱取2 g石油原液，將石油原液和二氯甲烷按照1∶1的體積比溶解，均勻噴灑到花盆中，靜置通風1周使二氯甲烷揮發(fā)完全，制得模擬油污土壤。分別取固定化小球及10 mL菌懸液均勻放入提前處理好的模擬油污土壤中，培養(yǎng)1周后測定土壤中石油烴含量，計算石油烴降解率。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

作為包埋載體，海藻酸鈉和殼聚糖濃度過高或過低都不利于固定化小球的成型。海藻酸鈉、殼聚糖添加量對固定化小球理化性質(zhì)的影響分別見表2、表3。在單因素實驗中，海藻酸鈉為2%或殼聚糖為0.25%時，固定化小球成球效果較差，容易形成絮狀不規(guī)則的片狀體。而海藻酸鈉為6%和殼聚糖為1.25%時，形成的固定化小球易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。小球的密度、穩(wěn)定性、傳質(zhì)性均隨著海藻酸鈉和殼聚糖添加量的增加而逐漸增加，小球破碎率則隨著兩者添加量的增加而逐漸降低。這說明，在相同的交聯(lián)時間內(nèi)，包埋載體濃度越大，固定化小球越堅硬。

表2 海藻酸鈉對固定化小球理化性質(zhì)的影響1)

表3 殼聚糖對固定化小球理化性質(zhì)的影響

包埋載體濃度的高低不僅對固定化小球的成球效果產(chǎn)生影響，同樣對石油烴降解率也會產(chǎn)生一定的影響。由圖1可以看出，隨著海藻酸鈉及殼聚糖質(zhì)量分數(shù)的增加，固定化小球的石油烴降解率先逐漸升高。當海藻酸鈉為4%、殼聚糖為1.00%時，固定化小球的石油烴降解率達到最大，分別為79.3%、88.8%。繼續(xù)增加海藻酸鈉及殼聚糖添加量，石油烴降解率又逐漸下降。

圖1 包埋載體質(zhì)量分數(shù)對固定化小球石油烴降解率的影響Fig.1 Effect of embedding carrier dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate of immobilized pellets

綜合考量固定化小球的理化性能及石油烴降解效果，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)宜為4%，殼聚糖質(zhì)量分數(shù)宜為1.00%。

除包埋載體添加量外，pH和NaCl濃度也會對固定化小球的石油烴降解率產(chǎn)生影響。根據(jù)前期實驗結果，采用海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4%，殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為1.00%下制得的固定化小球進行后續(xù)石油烴降解實驗。

由圖2(a)可見，在pH為6～9時，固定化小球?qū)κ蜔N降解率隨pH的升高先增大后減小，當pH為9時，石油烴降解率達到最大值74.1%。由圖2(b)可見，當NaCl質(zhì)量分數(shù)為3%～5%時，石油烴降解率隨NaCl質(zhì)量分數(shù)的升高而緩慢升高，當NaCl質(zhì)量分數(shù)達到5%時，石油烴降解率達到最大，為76.9%。當NaCl質(zhì)量分數(shù)超過5%時，石油烴降解率出現(xiàn)明顯降低。由此可知，采用固定化小球?qū)κ蜔N進行降解時，pH宜為9，NaCl質(zhì)量分數(shù)宜為5%。

圖2 pH及NaCl對石油烴降解率的影響Fig.2 Influence of pH and NaCl on the petroleum hydrocarbon degradation rate

2.2 正交實驗結果

固定化小球?qū)κ蜔N降解的正交實驗結果見表4。9組實驗中，第8組實驗的石油烴降解率最高，為87.5%，最優(yōu)組合為A2B2C1D3，由不同因素的R值可知，pH對石油烴降解率的影響最大。由表5可以看出，4個因素對石油烴降解率影響程度為pH>NaCl>殼聚糖>海藻酸鈉，其中，pH的P值為0.025，小于0.05，是顯著影響因素。

表4 正交實驗結果

表5 正交實驗方差分析1)

根據(jù)SPSS 22軟件，計算4個因素在不同水平下石油烴降解率的估算邊際平均值，估算邊際平均值越高，表示該水平下石油烴降解效果越好。從圖3可以看出，海藻酸鈉、pH、NaCl的最優(yōu)水平分別為4%、7和5%，當殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為0.75%、1.00%時，石油烴降解率估算邊際平均值相近，但考慮到殼聚糖為1.00%時固定化小球的理化性質(zhì)更佳，故認為殼聚糖的最優(yōu)水平為1.00%，這與正交實驗得到的最佳優(yōu)化組合一致，因此，固定化小球?qū)κ蜔N降解的最優(yōu)條件為海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4%、殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為1.00%、pH為7、NaCl質(zhì)量分數(shù)為5%。

圖3 石油烴降解率估算邊際平均值Fig.3 Estimated marginal average of petroleum hydrocarbon degradation rate

2.3 游離菌劑與固定化小球石油烴降解效果

經(jīng)過1周的培養(yǎng)，游離菌劑對模擬油污土壤中石油烴的降解率為45.9%，而固定化小球?qū)κ蜔N的降解率為70.6%，比游離菌劑提高24.7百分點，表明微生物菌劑在固定化后對石油污染土壤的修復效果更好。

3 討 論

石油烴降解菌能夠以石油烴作為唯一碳源進行生長，為其生長繁殖提供所需的能量，經(jīng)過一系列氧化還原、分解合成等自身代謝反應，將石油降解成無害的CO2與H2O，對石油污染環(huán)境具有很好的修復作用[20-22]。但石油烴組分差異較大，所以降解的難易程度也存在一定的差異，TIZZARD等[23]研究發(fā)現(xiàn)，微生物對不同烴類降解的先后次序為短鏈直鏈烷烴、長鏈直鏈烷烴、分支烷烴、單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴、雜環(huán)芳烴。微生物降解烴類物質(zhì)主要是利用體內(nèi)各種酶與石油烴及其中間產(chǎn)物發(fā)生脫氫作用、羥化作用和過氧化作用，在這些過程中，既包括有氧降解也包括厭氧降解，其中有氧降解占主導，而厭氧降解由于環(huán)境條件限制只能降解較少烴類[24]。劉五星等[25]通過接種石油烴降解菌、添加有機肥及調(diào)理劑等方式對含油污泥進行預制床生物修復，經(jīng)過230 d的修復處理，修復效率高達46.3%。本實驗所用的菌株Tust-DM21在前期全基因組測序中發(fā)現(xiàn)168個可能與石油烴降解相關的基因，包括常見的烷烴降解基因alkB、細胞色素p450編碼基因、常見的芳烴降解基因兒茶酚1,2-雙加氧酶以及一些其他雙加氧酶、單加氧酶等的編碼基因[26]。將菌株Tust-DM21在海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4%，殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為1.00%的條件下進行固定化來降解培養(yǎng)基中的石油烴，在pH為7，NaCl質(zhì)量分數(shù)為5%下培養(yǎng)5 d，石油烴降解率可高達80%以上，明顯高于他文獻中的石油烴降解率，這可能是因為本研究所用培養(yǎng)基都經(jīng)過高溫滅菌，沒有雜菌干擾，降解效果會比較明顯，同時也說明菌株Tust-DM21具有高效性，能夠在較短的時間內(nèi)高效率地降解石油。

固定化技術具有微生物密度高、反應迅速、微生物流失少等優(yōu)點，目前已成為生物、環(huán)境等領域的研究熱點[27]。在本實驗中，用海藻酸鈉和殼聚糖作為包埋載體對濃縮的菌懸液進行固定化包埋，固定化后的菌劑對石油烴有更高的降解效率，這跟包埋載體具有特殊的內(nèi)部結構有著很大的關系。胡曉亮等[28]研究表明，游離菌劑在包埋載體中能夠利用海藻酸鈉作為碳源生長，繁殖速度快，生長數(shù)量多。另外，李馨子等[29]通過對固定化小球進行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)包埋載體有特殊的孔隙結構，能夠保持良好的傳質(zhì)性，同時還可以保證細菌正常的生理代謝，又能屏蔽外界不利因素的侵害，有利于細菌在顆粒內(nèi)部生長繁殖，且細菌在交叉曲折網(wǎng)絡結構中不易泄漏，小球內(nèi)可以維持較高的細菌密度，因此固定化后的菌劑可以保持較高的降解效率。蘇增建等[30]利用海藻酸鈉為包埋載體，對石油烴降解菌進行固定化，用CaCl2交聯(lián)固定化小球并用于石油烴降解，得到海藻酸鈉最適質(zhì)量分數(shù)為4%，石油烴降解率最高為48.7%。呂榮湖等[31]利用海藻酸鈉和聚乙烯醇(PVA)作為包埋載體，利用CaCl2交聯(lián)微生物固定化小球，處理6 h后，固定化小球的除油率達到86%以上?？紤]到PVA本身屬于高分子材料，具有一定毒性，從成球效果和石油烴降解效果上看，殼聚糖更適合作為固定化小球的包埋載體[32]。在考慮環(huán)境因素對固定化微小球降解率的影響時，本研究只探討了pH和NaCl質(zhì)量分數(shù)對微生物菌劑成球效果和石油烴降解率的影響。在單因素實驗中，pH為9、NaCl質(zhì)量分數(shù)為5%時，菌株對于石油烴的降解率在70%以上。這個結果與姜天翔等[19]在pH為7.5、鹽度為3.3%、溫度為35 ℃時，微生物對石油烴降解率達90%以上的報道有所差別，這可能是由于本研究所用菌株Tust-DM21來自海洋石油勘探船廢油收集區(qū)，菌株所處環(huán)境復雜，且石油烴濃度較低，其活性適宜于降解較低濃度石油，但耐鹽性和耐pH的程度比較高。

4 結 論

利用包埋法對前期分離純化的石油烴高效降解菌Tust-DM21進行固定化，根據(jù)固定化小球的理化性質(zhì)和石油烴降解性能，利用四因素三水平的正交實驗對固定化參數(shù)進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)如下結論：(1)4個因素對石油烴降解率影響程度為pH>NaCl>殼聚糖>海藻酸鈉，其中pH為顯著影響因素；(2)石油烴降解的最佳條件為海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%、殼聚糖質(zhì)量分數(shù)1.00%、pH=7、NaCl質(zhì)量分數(shù)5%；(3)游離菌劑與固定化小球?qū)δM油污土壤中石油烴的降解率分別為45.9%、70.6%，石油烴降解菌經(jīng)固定化后具有更好降解效果。綜上，菌株Tust-DM21能夠在優(yōu)化條件下高效率地降解石油，且固定化處理后的菌劑石油烴降解效果比游離菌大幅升高，在石油污染的現(xiàn)場修復中具有更高的應用價值。