付強(qiáng) 陳俊貞 郭妍婷 姚剛 冉多良 史慧君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是引起牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙ovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）的主要病原［1］，主要感染牛、羊和駝科動(dòng)物，感染后常呈現(xiàn)體溫升高、腹瀉、黏膜充血及蹄葉炎等臨床癥狀［2］。此外，BVDV還會(huì)引起母牛流產(chǎn)、死胎及牛群持續(xù)性感染，給牛群健康管理造成危害［3］。BVDV可通過(guò)血液、排泄物等途徑水平傳播，感染BVDV的牛發(fā)病率高、病死率低；還可以通過(guò)懷孕母牛垂直傳播，感染孕牛產(chǎn)下的犢牛終身帶毒，持續(xù)排毒，是重要傳染源，同時(shí)也是生物制品、凍精、血清等主要污染源，BVDV是反芻動(dòng)物最嚴(yán)重的病原體之一，會(huì)對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，危害極大［4］。探明該病毒胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵因子途徑將為BVD的診斷和防控提供理論依據(jù)［5］。

α2抗纖溶酶（serpin peptidase inhibitor clade F member 2，SERPINF2）是編碼絲氨酸蛋白抑制劑SERPINF2家族的一員［6］。這個(gè)分子在1969年由Aoki等［7］發(fā)現(xiàn)，其主要的功能是能夠有效抑制纖溶過(guò)程，1976年Moroi和Aoki［8］從人血漿中成功分離并鑒定了這個(gè)纖溶抑制劑。因?yàn)樗軌蜓杆僖种评w溶酶活性并且免疫電泳遷移速度與α2球蛋白相當(dāng)，因此命名為 α2-plasmin inhibitor［9］。

本課題組前期使用BVDV TC株感染Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）建立轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)SERPINF2基因表達(dá)量顯著性上調(diào)［10］，該基因是否是BVDV胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵因子，對(duì)BVDV的胞內(nèi)復(fù)制有何影響尚未見(jiàn)研究。本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除SERPINF2基因，研究SERPINF2基因?qū)VDV復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒及細(xì)胞 BVDV新疆分離株TC由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室冉多良教授惠贈(zèng)［11］；pSPAX2（12260）、pMD2.G（12259）、lentiCRISPR v2（53961）質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene；MDBK細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）購(gòu) 自 美 國(guó) Polysciences公 司；TRIzol購(gòu) 自Ambion公司；BsmB I、和T4 DNA Ligase購(gòu)自New England Biolabs公 司；聚 凝 胺（TR-1003）購(gòu) 自Sigma公司 ；Endofree Plasmid Miniprep Kit（PD1212）購(gòu)自BIOMIGA公司；高糖DMEM、胎牛血清FBS、山羊血清和0.25% Trypsin-EDTA購(gòu)自BI公司；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（RR036A）購(gòu)自TaKaRa公司；嘌呤霉素購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Marker Ⅰ（MD101）、PCR MIX、D2000 DNA Marker（MD114）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP210）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；常規(guī)的化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；ABI 7500 Fast Real-Time PCR System購(gòu)自美國(guó)ABI公司；倒置熒光顯微鏡（Nikon TE2000U）購(gòu)自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA序列設(shè)計(jì)、合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中SERPINF2（登錄號(hào)：282522）基因序列用Benchling（https：//benchling.com）設(shè)計(jì)，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。分別取10 μL sgRNA正、反單鏈（100 μmol/L），混勻后置于37℃孵育30 min，95℃孵育5 min，以5℃/min速度降溫至25℃，置于-20℃保存。

表1 sgRNA序列Table 1 SgRNA sequences

1.2.2 lentiCRISPR v2-SERPINF2-sgRNA質(zhì) 粒 構(gòu)建 用BsmB I限制性內(nèi)切酶酶切l(wèi)entiCRISPR v2質(zhì)粒后，用1% DNA凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。該質(zhì)粒酶切后會(huì)得到兩條不同大小的DNA片段，將12 988 bp大小的目的條帶用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。將回收產(chǎn)物和sgRNA雙鏈用T4 DNA連接酶4℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，涂板后培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單克隆菌落，PCR和測(cè)序鑒定。

1.2.3 SERPINF2 KO細(xì)胞建立 六孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔用500 μL的0.1%明膠包被30 min后棄明膠，接種5×105個(gè)HEK-293T細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，分別取3 μg lentiCRISPR v2-SERPINF2-sgRNA 質(zhì)粒、3 μg pSPAX2質(zhì)粒和 1.5 μg PMD2.G 質(zhì)粒與 38.5 μL PEI（1 mg/mL）混勻，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液中。孵育3 h后更換正常細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液1 500 r/min離心5 min，收集上清液懸浮感染MDBK細(xì)胞，同時(shí)加入聚凝胺（8 μg/mL）增加感染效率。感染24 h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入嘌呤霉素（4 μg/mL）篩選4代獲得陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.4 SERPINF2敲除效率檢測(cè) 收集SERPINF2 KO細(xì)胞，使用基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段，將目的片段回收后連接到pMD18-simple T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，單克隆菌落經(jīng)PCR后，隨機(jī)挑選30個(gè)單克隆菌落送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增所用引物序列為F ：5′-AGTACAGGGGCTTTGAAGGAAATCT-3′，R ：5′-TCCAGTCCAAAAGAGACACTGGAAC-3′。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)SERPINF2基因和BVDV RNA水平 將MDBK細(xì)胞按照5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，加入1 000 TCID50BVDV感染細(xì)胞，分別于感染后36 h、48 h時(shí)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液并加入TRIzol裂解液裂解，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA成cDNA；以cDNA為模板，使用qRT-PCR檢測(cè)SERPINF2 mRNA水平［10］。

分別接種等量的SERPINF2 KO細(xì)胞和對(duì)照組Scramble細(xì)胞并感染1 000 TCID50的BVDV，分別于感染后0、12、24、36、48 h時(shí)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA成cDNA，同上采用 qRT-PCR 檢測(cè) BVDV 5′UTR RNA 水平［12］。

1.2.6 免疫熒光染色檢測(cè)BVDV雙鏈RNA含量 將SERPINF2 KO和Scramble細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔的密度接種至鋪有爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用1 000 TCID50BVDV分別感染12、24、36、48 h后棄掉培養(yǎng)液，加200 μL 4%多聚甲醛室溫下固定15 min，加入200 μL封閉液（1%山羊血清+3% BSA+1% Triton X-100，溶于PBS）室溫下孵育1 h，加入J2 anti-dsRNA IgG2a單克隆抗體（1∶1 200稀釋）4℃孵育過(guò)夜。加入Cy3標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）二抗（1∶200稀釋）避光室溫孵育1 h，封片在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況。

1.2.7 BVDV CPE情況和病毒滴度檢測(cè) 將SERPINF2 KO細(xì)胞和對(duì)照Scramble細(xì)胞按照1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，加入1 000 TCID50BVDV感染細(xì)胞，分別于感染后12、24、36和48 h時(shí)，使用倒置顯微鏡觀察CPE情況；并將細(xì)胞和培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，收集病毒懸液至1.5 mL離心管，1 000 r/min離心10 min收集上清液，使用Reed-Muench方法測(cè)定各上清液病毒滴度［12］。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 17.0 for Windows（SPSS Inc.Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*表示通過(guò)t檢驗(yàn)確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（*P ＜0.05；**P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 lentiCRISPR v2質(zhì)粒酶切菌液PCR鑒定結(jié)果

使用限制性內(nèi)切酶BsmB I酶切l(wèi)entiCRISPR v2載體，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到兩條清晰的條帶，其中小片段大小約2 000 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

2.2 SERPINF2基因敲除效率檢測(cè)

應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除SERPINF2基因，收集部分細(xì)胞，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段，克隆至pMD18-simple T載體中，隨機(jī)送樣測(cè)序檢測(cè)SERPINF2基因敲除效率。結(jié)果顯示，測(cè)序成功的27株陽(yáng)性克隆中有19株基因序列發(fā)生缺失（-）和插入（+）等移碼突變，共有70.37%（19/27）樣本的基因發(fā)生改變（圖2），表明MDBK細(xì)胞的SERPINF2基因敲除率為70.37%。

圖1 lentiCRISPR v2質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of lentiCRISPR V2 plasmid by enzyme digestion

WT：野生型；-：堿基缺失；+：堿基插入；數(shù)字：堿基個(gè)數(shù)；（數(shù)字）：缺失或插入等突變的克隆數(shù)WT：wild type, -：base deletion, +：base insertion, Number：base number, (Number)：Clone number of mutation such as deletion or insertion

2.3 qRT-PCR檢測(cè)SERPINF2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

為檢測(cè)BVDV感染SERPINF2表達(dá)的影響，對(duì)BVDV感染MDBK細(xì)胞36和48 h后，使用qRTPCR檢測(cè)SERPINF2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未感染BVDV相比，BVDV感染36 h和48 h時(shí)SERPINF2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別提高約3.19和12.46倍（圖3），表明BVDV感染MDBK細(xì)胞顯著性提高SERPINF2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后BVDV RNA水平

BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞和對(duì)照組Scramble細(xì)胞12、24、36、48 h后，提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)BVDV 5′UTR RNA水平。結(jié)果顯示與對(duì)照組Scramble細(xì)胞相比，BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞12 h后BVDV RNA水平顯著降低（圖4）。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)BVDV感染MDBK細(xì)胞后SERPINF2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcription levels of SERPINF2 mRNA in the MDBK cells infected by BVDV via qRT-PCR

圖4 qRT-PCR檢測(cè)BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后BVDV RNA水平Fig.4 qRT-PCR detection of BVDV RNA level in the SERPINF2 KO cells infected with BVDV

2.5 免疫熒光染色檢測(cè)BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后BVDV dsRNA含量

BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞和對(duì)照組Scramble細(xì)胞12、24、36、48 h，用免疫熒光染色后觀察細(xì)胞內(nèi)BVDV sgRNA的分布情況，激光共聚焦顯微鏡下BVDV dsRNA呈紅色熒光，結(jié)果可見(jiàn)SERPINF2 KO細(xì)胞中紅色熒光顯著少于對(duì)照組Scramble細(xì)胞（圖5），表明BVDV dsRNA含量降低，BVDV的復(fù)制被阻止。

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后BVDV雙鏈RNA含量結(jié)果Fig.5 Detection of BVDV dsRNA accumulation in the SERPINF2 KO cells infected with BVDV by immunofluorescence staining

2.6 BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后病毒滴度檢測(cè)

BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞和對(duì)照組Scramble細(xì)胞12、24、36、48 h，反復(fù)凍融后收集病毒懸液，使用Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度變化。結(jié)果顯示BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞12 h后的病毒滴度與對(duì)照組Scramble細(xì)胞相比顯著性降低（圖6）。結(jié)果表明敲除SERPINF2基因能夠顯著性阻止BVDV復(fù)制。

圖6 BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后病毒滴度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of virus titer in the SERPINF2 KO cells infected with BVDV

2.7 BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后CPE檢測(cè)結(jié)果

BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞和對(duì)照Scramble細(xì)胞12、24、36、48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞CPE情況。結(jié)果顯示BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞24 h后CPE明顯少于對(duì)照組，BVDV感染36 h后對(duì)照組Scramble細(xì)胞大量病變脫落，SERPINF2 KO細(xì)胞雖出現(xiàn)較多病變，但細(xì)胞脫落情況較少（圖7）。表明敲除SERPINF2基因能夠抑制BVDV感染造成的細(xì)胞CPE。

圖7 BVDV感染SERPINF2 KO細(xì)胞后致細(xì)胞病變效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Detection results of cytopathic effect in the SERPINF2 KO cells infected with BVDV

3 討論

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除靶基因，選擇靶基因的識(shí)別序列（sgRNA識(shí)別序列）是關(guān)鍵。目標(biāo)基因的識(shí)別序列一般是在前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）三聯(lián)核昔酸結(jié)構(gòu)（NGG或者NAG，N代表任何堿基）前的20個(gè)左右的DNA堿基序列［13］。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)SERPINF2基因的敲除，原則上可以將目標(biāo)序列設(shè)計(jì)在SERPINF2基因啟動(dòng)子或外顯子區(qū)域，進(jìn)行敲除對(duì)SERPINF2基因目標(biāo)序列進(jìn)行切割并經(jīng)HDR修復(fù)時(shí)引入突變。理論上可行的sgRNA識(shí)別片段不一定能最終實(shí)現(xiàn)基因的敲除，所以本實(shí)驗(yàn)嘗試性設(shè)計(jì)了3個(gè)符合條件的SERPINF2基因的sgRNA識(shí)別序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)SERPINF2基因的有效敲除。最終成功敲除MDBK細(xì)胞的SERPINF2基因，敲除效率為70.37%。為研究SERPINF2基因?qū)VDV的胞內(nèi)復(fù)制的影響及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

SERPINF2是SERPIN超家族的重要成員，其主要作用是通過(guò)抑制plasmin活性參與抗溶血，阻礙細(xì)胞因子生成、血管發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程［14］。有病歷研究發(fā)現(xiàn)，SERPINF2突變會(huì)造成胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)異常和功能障礙［15］。BVDV TC株感染ICC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異性分析發(fā)現(xiàn)，SERPINF2基因表達(dá)量顯著性上調(diào)［10］，感染MDBK細(xì)胞也得到同樣的結(jié)果，考慮SERPINF2敲除會(huì)引起胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)異常和功能障礙，從而影響B(tài)VDV的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。

本研究發(fā)現(xiàn)BVDV感染MDBK細(xì)胞后SERPINF2基因表達(dá)量上調(diào)，與前期建立的BVDV感染宿主細(xì)胞建立的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜相一致。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立SERPINF2敲除的MDBK細(xì)胞SERPINF2 KO，并驗(yàn)證敲除SERPINF2基因能夠顯著性降低BVDV RNA水平、dsRNA積累，降低CPE情況和病毒滴度，表明SERPINF2敲除影響B(tài)VDV在宿主細(xì)胞中復(fù)制，而該基因通過(guò)何種途徑影響B(tài)VDV的復(fù)制將在后續(xù)研究中深入探索。

4 結(jié)論

BVDV感染MDBK細(xì)胞SERPINF2基因表達(dá)量上調(diào)；利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功建立SERPINF2 KO細(xì)胞，敲除率為70.37%；SERPINF2基因敲除能夠抑制BVDV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。