崔祥華 陶南 程波普 趙永昌 陳衛(wèi)民 李靖

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650223）

隨著食用真菌遺傳體系的深入研究與建立，越來越多的啟動(dòng)子被用于表達(dá)體系，尋找適合于不同菌類的啟動(dòng)子，對(duì)于構(gòu)建高效的表達(dá)體系十分必要。目前，研究者對(duì)食藥用菌中的多個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆和序列分析，如香菇Lentinula edodes和草菇Volvariella volvacea中ras（ras gene）啟動(dòng)子、香菇和靈芝Ganoderma lucidum中g(shù)pd（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase）啟動(dòng)子、雙孢菇Agaricusbisporus中spr1（serine proteinase gene）啟動(dòng)子、cel1（tryptophan synthetase gene）啟動(dòng)子和cel3啟動(dòng)子、香菇 gal1（glu-coamylase gene）啟動(dòng)子等［1-5］。目前，真菌著力于選擇使用強(qiáng)啟動(dòng)子和同源啟動(dòng)子，以增強(qiáng)靶標(biāo)基因的表達(dá)量，而同源啟動(dòng)子能識(shí)別調(diào)控因子，降低甲基化頻率，提高其轉(zhuǎn)化效率［6］。但也存在一些異源啟動(dòng)子活性較強(qiáng)的現(xiàn)象，如研究者利用蟬棒束孢菌Isaria cicadae內(nèi)源gpd、tef（translation elongation factor）和組蛋白（histone）H3啟動(dòng)子分別與來自稻瘟病Magnaporthe grisea的H3和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）sod基因啟動(dòng)子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)稻瘟病H3啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng)［7］。因此，選擇高效、適宜的啟動(dòng)子對(duì)于研究其功能基因過量表達(dá)有著重要意義。目前為止，研究者對(duì)香菇［8］、雙孢菇［9］、金針菇 Flammulina velutipes［10］、平菇 Pleurotus ostreatus［11］、靈芝［12］等主要食藥用菌都使用gpd啟動(dòng)子構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，其它啟動(dòng)子用于表達(dá)體系的研究較少。

柱狀田頭菇（Cyclocybe aegerita），又稱茶樹菇［13］，是一種溫帶至亞熱帶地區(qū)春秋季生長的廣溫型木腐性食用菌，在國內(nèi)外有著廣泛的種植。目前為我國的第九大類食用菌種植菌類，當(dāng)前可開發(fā)的十大珍稀食用菌之一［14］。隨著柱狀田頭菇遺傳發(fā)育及育種研究的深入，需要建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以滿足其遺傳及性狀等方面解析的需要。前期研究中利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，結(jié)合熒光蛋白EGFP表達(dá)，建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步開展柱狀田頭菇的基因功能研究提供了研究手段［15］，但未對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)量做定量分析，缺乏對(duì)啟動(dòng)子引導(dǎo)基因表達(dá)做綜合分析。

因而本研究利用基因組數(shù)據(jù)，分析gpd和actin基因序列特征，分別用不同長度基因片段作為啟動(dòng)子，與原始載體中的啟動(dòng)子做比對(duì)分析，進(jìn)而對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，期望篩選到穩(wěn)定高效的啟動(dòng)子和區(qū)域，為后期柱狀田頭菇基因功能分析提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：柱狀田頭菇菌株YSG，保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種庫。菌絲置于YPD固體培養(yǎng)基（0.2%蛋白胨，0.2%酵母粉，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉，pH自然）中進(jìn)行培養(yǎng)。質(zhì)粒pAa含有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph與綠色熒光蛋白編碼基因egfp。

高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、重組克隆試劑盒ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）；RNA提取試劑盒Plant RNA Extraction Kit、限制性核酸內(nèi)切酶（寶生物工程大連有限公司）；膠回收試劑盒E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit、質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini KitⅠ、DNA提取試劑盒Fungal gDNA Isolation Kit（Omega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit（with gDNase）（北京天根生化科技有限公司）；感受態(tài)細(xì)胞 TreliefTM5αChemically Competent Call（北京擎科生物科技有限公司）；溶壁酶（lywallzyme）（廣東碧德生物科技公司）；裂解酶（lysing enzyme）、纖維素酶R-10、潮霉素B（Sigma公司）；Real-time PCR試劑盒iTaqTMUniversal SYBR Green supermix（美國Bio-Rad公司）。本研究所用引物合成及測(cè)序交由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 提取柱狀田頭菇菌株YSG的總DNA與RNA，通過反轉(zhuǎn)錄其RNA得到cDNA。根據(jù)CE Design V1.04設(shè)計(jì)引物，并在各連接片段的5′端與3′端加6-21 bp同源臂（表1），進(jìn)行不同類型和長度啟動(dòng)子的靶標(biāo)基因擴(kuò)增。PCR 采用 50 μL 反應(yīng)體系，包括 1 μL Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25 μL 2×Phanta?Max Buffer，1 μL dNTP Mix（10 mmol/L each），正向和反向引物（10 μmol/L）各 2 μL，100 ng模板 DNA，用無菌去離子水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增體系采用95℃預(yù)變性3 min；9 5℃變性 15 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 60 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳獲得的片段膠回收備用。

用限制性核酸內(nèi)切酶Pst I與EcoR V雙酶切質(zhì)粒pAa，酶切產(chǎn)物通過凝膠純化回收，將其原有的egfp基因及其啟動(dòng)子替換成啟動(dòng)子actin-1、gpd-1、actin-2、gpd-2、Pumgpd和靶標(biāo)基因mek（圖1）。使用ClonExpress DNA多片段無縫克隆技術(shù)將啟動(dòng)子、功能基因片段順序拼接克隆，分別得到重組載體pAa-actin-1、pAa-actin-2、pAa-gpd-1、pAa-gpd-2 和pAa-Pumgpd。

設(shè)計(jì)通用引物pAa-F/pAa-R擴(kuò)增5個(gè)重組載體的轉(zhuǎn)化用DNA長片段，PCR產(chǎn)物切膠回收后送交北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)序。測(cè)序正確的五個(gè)重組載體的DNA長片段通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)進(jìn)菌株YSG的原生質(zhì)體，通過潮霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子。具體實(shí)驗(yàn)方法同陶南等［15］的實(shí)驗(yàn)方法。提取轉(zhuǎn)化子DNA，設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物PM-F/PM-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序鑒定出陽性轉(zhuǎn)化子。

圖1 載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè) 提取陽性轉(zhuǎn)化子的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到其對(duì)應(yīng)的cDNA。選取柱狀田頭菇菌株YSG中的gpd基因作為內(nèi)參，應(yīng)用DNAMAN設(shè)計(jì)熒 光 定 量 PCR引 物：qMek-F、qMek-R、qgpd-F、qgpd-R（表1）。采用 20 μL 反應(yīng)體系 ：10 μL iTaqTMUniversal SYBR?Green supermix（2×），1 μL正向引物，1 μL反向引物，8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 啟動(dòng)子與靶標(biāo)基因mek片段的獲得

擴(kuò)增出的5個(gè)啟動(dòng)子片段長度分別為1 055 bp（actin-1）、600 bp（actin-2）、1 084 bp（gpd-1）、700 bp（gpd-2）、585 bp（Pumgpd）；靶標(biāo)基因 mek加上兩端同源臂序列后，片段長度約為1 180 bp（分別命名為Mek-A1、Mek-G1、Mek-A2、Mek-G2和Mek-PG）。通過凝膠電泳檢測(cè)，各啟動(dòng)子與mek片段長度與預(yù)期相符（圖2），產(chǎn)物片段測(cè)序結(jié)果與原序列一致。

2.2 啟動(dòng)子序列與元件分析

通過PlantCARE啟動(dòng)子在線分析軟件，對(duì)基因actin、gpd、Pumgpd起始密碼子上游啟動(dòng)子序列中作用元件進(jìn)行分析。在啟動(dòng)子中，根據(jù)TATA-box與CAAT-box的作用。其中TATA-box又稱核心啟動(dòng)子，為RNA聚合酶的結(jié)合處之一，與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)；CAAT-box作為真核生物分布較廣的基因調(diào)節(jié)區(qū)，控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。在actin啟動(dòng)子中（圖3-A），存在1個(gè)TATA-box元件，6個(gè)CAAT-box元件。在gpd啟動(dòng)子中（圖3-B），存在3個(gè)TATA-box元件，6個(gè)CAAT-box元件。在Pumgpd啟動(dòng)子中（圖3-C），存在2個(gè)CAAT-box元件。

2.3 轉(zhuǎn)化用DNA長片段獲取

通過多片段無縫克隆技術(shù)將啟動(dòng)子actin-1、gpd-1、actin-2、gpd-2、Pumgpd分別與功能基因mek順序連接到載體pAa上得到5個(gè)重組載體pAaactin-1、pAa-actin-2、pAa-gpd-1、pAa-gpd-2和 pAa-Pungpd。用通用引物pAa-F/pAa-R分別擴(kuò)增重組載體獲得對(duì)應(yīng)的用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的DNA長片段（圖4），片段長度7 200 bp左右，包含了重組載體LB和RB之間的DNA片段。

圖2 啟動(dòng)子與mek片段擴(kuò)增Fig.2 Amplification fragments of promoters and mek

圖3 啟動(dòng)子序列元件特征Fig.3 Characterization of promoter sequences and elements

2.4 柱狀田頭菇遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子菌絲透過上層潮霉素篩選培養(yǎng)基形成白色菌落（圖5-A），挑取白色菌落重新置于YPD（含150 μg/mL HYG）培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，轉(zhuǎn)化子在復(fù)篩時(shí)都能正常生長（圖5-B）。

將挑取的轉(zhuǎn)化子提取DNA，用引物PM-F/PM-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖6）顯示轉(zhuǎn)化子中均含有重組后的啟動(dòng)子和目的基因片段，說明挑取的轉(zhuǎn)化子均為陽性轉(zhuǎn)化子，可以用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。

2.5 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)靶標(biāo)基因表達(dá)水平

圖4 重組質(zhì)粒中轉(zhuǎn)化片段擴(kuò)增Fig.4 Amplification of transformation fragments in the recombinant plasmids

以YSG中g(shù)pd作為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR來檢測(cè)功能基因mek的表達(dá)量。結(jié)果顯示（圖7），挑選出攜帶actin-1啟動(dòng)子的10個(gè)轉(zhuǎn)化子中，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)化子有7個(gè)，過表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率達(dá)70%，表達(dá)量為對(duì)照3倍以上轉(zhuǎn)化子有5個(gè)，最高表達(dá)量為對(duì)照的10.45倍；攜帶 actin-2啟動(dòng)子的3個(gè)轉(zhuǎn)化子中，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)化子有3個(gè)，過表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率達(dá)100%，表達(dá)量為對(duì)照3倍以上轉(zhuǎn)化子有1個(gè)，最高表達(dá)量為對(duì)照的6.23倍；攜帶gpd-1啟動(dòng)子的13個(gè)轉(zhuǎn)化子中，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)化子有9個(gè)，過表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率達(dá)69.24%，表達(dá)量均低于對(duì)照的3倍，最高表達(dá)量為對(duì)照的2.93倍；攜帶gpd-2啟動(dòng)子的7個(gè)轉(zhuǎn)化子中，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)化子有6個(gè)，過表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率達(dá)85.71%，表達(dá)量為對(duì)照3倍以上轉(zhuǎn)化子有2個(gè)，最高表達(dá)量為原始啟動(dòng)子的7.75倍；攜帶Pumgpd啟動(dòng)子的4個(gè)轉(zhuǎn)化子中，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)化子有3個(gè)，過表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率達(dá)75%，表達(dá)量為對(duì)照3倍以上轉(zhuǎn)化子有1個(gè)，最高表達(dá)量為對(duì)照的4.31倍。綜合分析顯示，pAa-actin-1和pAa-actin-2兩個(gè)啟動(dòng)子控制的過量表達(dá)及高表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率較其它3個(gè)啟動(dòng)子高，適用于構(gòu)建柱狀田頭菇穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)化體系。

圖5 潮霉素抗性平板上轉(zhuǎn)化子的篩選Fig.5 Screening of transformants on HYG plates

圖6 部分轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證Fig.6 PCR verification of partial transformants

3 討論

隨著越來越多食用菌基因組測(cè)序工作的完成，對(duì)于食用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的研究也更深入，為后續(xù)基因功能分析奠定重要的基礎(chǔ)。啟動(dòng)子作為控制基因轉(zhuǎn)錄的重要元件，與功能基因的表達(dá)及其表達(dá)程度密切相關(guān)，是建立穩(wěn)定高效遺傳轉(zhuǎn)化體系過程中關(guān)鍵組成部分。盡管研究者已從眾多物種中分離獲得了多種基因啟動(dòng)子用于載體構(gòu)建，然而適合于不同物種的啟動(dòng)子不盡相同，需要進(jìn)行全面篩選以找到合適的目標(biāo)啟動(dòng)子。

在前期研究中，利用actin作為啟動(dòng)子，我們構(gòu)建了柱狀田頭菇的遺傳轉(zhuǎn)化體系，菌絲中呈現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)［15］。本研究中進(jìn)一步構(gòu)建了不同基因和不同長度actin、gpd和Pumgpd啟動(dòng)子的表達(dá)載體，其中actin啟動(dòng)子選取全長actin-1與部分序列actin-2，所獲得的過表達(dá)和高表達(dá)轉(zhuǎn)化子比率比其它啟動(dòng)子更高，適合于后期的過表達(dá)載體構(gòu)建。研究者多認(rèn)為內(nèi)源啟動(dòng)子更適合菌株本身驅(qū)動(dòng)靶標(biāo)基因的表達(dá)［16］，即與本研究中內(nèi)源啟動(dòng)子gpd和actin優(yōu)于外源Pumgpd結(jié)果相似，但也存在異源啟動(dòng)子優(yōu)于本身內(nèi)源啟動(dòng)子的現(xiàn)象［17-19］。由此可見，研究者在構(gòu)建過表達(dá)載體時(shí)，進(jìn)行啟動(dòng)子的對(duì)比篩選非常必要。

圖7 5個(gè)啟動(dòng)子片段控制的mek基因表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of mek gene controlled by five promoter fragments

此外，由于啟動(dòng)子片段大小可能會(huì)影響靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄活性，推測(cè)轉(zhuǎn)錄元件的數(shù)量與種類造成啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體結(jié)合差異造成［20］，而本研究中不同長度的actin和gpd作為啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)的靶標(biāo)基因表達(dá)量也有差異，其中攜帶長片段actin-1比段片段actin-2高表達(dá)（表達(dá)量為對(duì)照3倍以上）轉(zhuǎn)化子得率高，而攜帶短片片段gpd-2比gpd-1高表達(dá)轉(zhuǎn)化子得率高。因此選取的啟動(dòng)子片段大小對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)確實(shí)有影響，但是造成驅(qū)動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)差異的原因還需要進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)柱狀田頭菇內(nèi)源gpd和actin基因啟動(dòng)子不同長度片段及外源啟動(dòng)子Pumgpd分別構(gòu)建過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后挑選陽性轉(zhuǎn)化子，對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，其中利用actin啟動(dòng)子構(gòu)建的載體比其它基因啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)載體所獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子得率更高，適用于后期的基因功能分析研究。