馮翠蓮 萬玥 王俊剛 馮小艷 趙婷婷 王文治 沈林波 張樹珍，

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所甘蔗研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用以來，全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用快速發(fā)展。2018年全球26個(gè)國家種植了1.917×108hm2轉(zhuǎn)基因作物，比2017年增長1%，2019年全球共有43項(xiàng)關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的批準(zhǔn)，有9個(gè)新的轉(zhuǎn)基因作物品種獲得批準(zhǔn)，包括油菜，棉花、豇豆、大豆和甘蔗。而我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也公示了192個(gè)擬頒發(fā)“農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書”的植物品種［1］。由此可見轉(zhuǎn)基因作物種植及應(yīng)用在未來仍然持續(xù)保持穩(wěn)定增長，轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題早已成為國際社會關(guān)注的熱點(diǎn)，因此對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行有效的評估與后續(xù)的監(jiān)管是當(dāng)前亟需的問題。

每一個(gè)轉(zhuǎn)化事件中，攜帶外源基因的T-DNA在受體植物的插入都是隨機(jī)的，從而造成T-DNA左右兩側(cè)與受體植物基因組的連接區(qū)域的堿基序列的不同，因此T-DNA側(cè)翼序列的克隆以及定位是明確轉(zhuǎn)基因作物的分子特征的基礎(chǔ)，對于轉(zhuǎn)基因植株的身份識別具有重要意義［2］；另一方面T-DNA在受體基因組中的插入位點(diǎn)對外源基因和受體內(nèi)源基因的表達(dá)均有可能產(chǎn)生互相影響，因此分析T-DNA的插入位點(diǎn)對于研究轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定遺傳有重要的意義［3］。所以T-DNA插入位點(diǎn)信息，側(cè)翼序列和拷貝數(shù)等轉(zhuǎn)基因作物的分子特征是轉(zhuǎn)基因生物安全評估和后續(xù)監(jiān)測的基礎(chǔ)，有助于充分評估轉(zhuǎn)基因植物的安全性。

目前獲取T-DNA側(cè)翼序列最常用的技術(shù)之一是染色體步移法（genome walking），染色體步移法是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展而來，大體上分為依賴酶切連接與不依賴酶切連接的兩類。依賴酶切連接的染色體步移法由于酶切位點(diǎn)分布隨機(jī)造成連接效率偏低，從而引起PCR擴(kuò)增效率下降，導(dǎo)致成功率降低。另一類不依賴酶切連接的染色體步移法操作簡便，不受酶切位點(diǎn)影響的優(yōu)點(diǎn)，雖然非特異擴(kuò)增較多，但經(jīng)過3-4輪的巢式PCR擴(kuò)增，仍然可以獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［4-5］。利用此類技術(shù)已經(jīng)成功分離了轉(zhuǎn)基因水稻［6-8］、玉米［9］、棉花［10］、小麥［11-12］和馬鈴薯［13］等T-DNA側(cè)翼序列，并建立其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化事件特異性檢測技術(shù)；轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化事件特異性檢測技術(shù)是以其轉(zhuǎn)基因T-DNA側(cè)翼序列的部分序列為靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物是T-DNA 5′端或3′端序列與受體基因組的拼接序列，因此具有高度特異性，可準(zhǔn)確識別不同的轉(zhuǎn)基因作物品系。

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是世界上最重要的一類糖料作物，其產(chǎn)蔗糖產(chǎn)量占世界食糖量的65%［14］。我國甘蔗糖量占全國總糖量的90%。但在各個(gè)甘蔗生產(chǎn)區(qū)，甘蔗在整個(gè)生長發(fā)育期內(nèi)均會受到120余種蟲害威脅［15-16］?？瓜x品種的培育一直都是甘蔗育種工作的一個(gè)重要目標(biāo)，目前抗蟲轉(zhuǎn)基因育種是甘蔗抗蟲育種最有效的途徑之一。本文作者前期利用具有自我剪切功能的FMDV2A連接多肽連接人工改造后的 Cry1Ac和gna 基因，融合成Cry1Ac-2A-gna抗蟲基因，并由玉米Ubi強(qiáng)啟動子驅(qū)動，以pCAMBIA3300質(zhì)粒為骨架，構(gòu)成抗蟲植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)把Cry1Ac-2A-gna抗蟲融合基因轉(zhuǎn)入甘蔗新臺糖22號，經(jīng)過2個(gè)無性繁殖世代的抗蟲性和遺傳穩(wěn)定性的評價(jià)和深入農(nóng)藝性狀鑒定，已獲得對甘蔗條螟等各類螟蟲具有良好的抗蟲性、外源基因穩(wěn)定遺傳和農(nóng)藝性狀優(yōu)良的BCG-17株系，該株系正準(zhǔn)備進(jìn)行環(huán)境釋放。為了明確轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的分子特征及便于其檢測，推進(jìn)其生物安全性評價(jià)工作，本實(shí)驗(yàn)以其無性繁殖T2代為植物材料，首先利用Southern雜交檢測外源T-DNA在BCG-17中的插入拷貝數(shù)；然后利用染色體步移技術(shù)分離其T-DNA側(cè)翼序列，并根據(jù)T-DNA左右側(cè)翼序列設(shè)計(jì)檢測引物，建立轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法，同時(shí)檢驗(yàn)該方法的特異性與靈敏度，為該轉(zhuǎn)基因甘蔗及其衍生產(chǎn)品的檢測和身份識別提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為轉(zhuǎn)cry1Ac-2A-gna 融合抗蟲基因和bar抗除草劑基因的甘蔗BCG-17株系，是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗新臺糖22號（ROC22）胚性愈傷而獲得，由本實(shí)驗(yàn)室保存，已申請?jiān)诤Ｄ鲜〉闹虚g試驗(yàn)。植物表達(dá)載體以 pCAMBIA3300為骨架，其T-DNA區(qū)從右到左依次包括Ubi啟動子、cry1Ac-2A-gna融合基因、NOS終止子、雙35S啟動子、bar基因和PolyA。cry1Ac-2A-gna融合基因全長為2 367 bp， 其 中 cry1Ac為 1845 bp、2A 為 51 bp、gna為471 bp。Dig nucleic acid detection kit、PCR DIG Probe Synthesis Kit購于德國羅氏公司；HyboodTM-N+尼龍膜購自美國GE Amersham；Genome Walking Kit、試劑 LA Taq酶、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、T4 DNA Ligase等購于TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒及純化試劑盒購于Axygen公司；2×Taq plus MasterMix、DNA Marker購于Biosharp公司；氨芐青霉素，瓊脂糖購于Sigma公司。PCR引物合成及基因測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗BCG-17基因組DNA的提取 選擇轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的無性繁殖T2代甘蔗的幼嫩葉片，采用改良CTAB法大量提取并純化基因組總DNA［17］，同時(shí)提取非轉(zhuǎn)基因甘蔗ROC22基因組總DNA 作為對照。取 2 μL于 Thermo Scientific Nano Drop One 生物核酸定量檢測儀測定DNA的濃度和純度，另取2 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.2.2 Southern雜交檢測 以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pNUBG為模板，利用高效PCR地高辛標(biāo)記法分別制備BG（包括Cry1Ac-2a-gna中Cry1Ac基因下游355 bp，2a和gna全長）、bar、sta、kan四種不同的探針，擴(kuò)增引物、退火溫度、產(chǎn)物長度等詳見表1。通過分析T-DNA區(qū)的酶切位點(diǎn)，結(jié)合各探針在T-DNA上的位置（圖1），分別選擇3種限制性內(nèi)切酶對30 μg基因組DNA進(jìn)行酶切（不同探針使用的內(nèi)切酶詳見表4），低電壓電泳后，轉(zhuǎn)膜至 HyboodTM-N+尼龍膜，再利用相應(yīng)的探針，進(jìn)行Southern 雜交檢測，雜交溫度40℃，預(yù)雜交時(shí)間2 h，雜交時(shí)間16 h，室溫黑暗條件下用BCIP / NBT進(jìn)行化學(xué)顯色，待雜交信號帶清晰后終止顯色，拍照并分析。具體操作參考試劑盒說明書和本研究團(tuán)隊(duì)成員崔學(xué)強(qiáng)發(fā)表的文章［18］。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的T-DNA左右側(cè)翼序列的獲取 按照染色體步移試劑盒中的要求，在植物表達(dá)載體pNUBG的T-DNA左右端序列分別設(shè)計(jì)4條退火溫度約為65℃的嵌套特異性引物（Lsp1-Lsp4和Rsp1-Rsp4），位置見圖2，序列見表2。由于不同植物物種基因組的差異，為了增加試劑盒使用的廣譜性，試劑盒提供了4種隨機(jī)簡并引物，按照操作說明，每種隨機(jī)簡并引物AP1-AP4分別與嵌套特異性引物組合配對，進(jìn)行三-四輪巢式PCR擴(kuò)增分離該株系的T-DNA左右側(cè)翼序列。第一輪反應(yīng)體系中，BCG-17基因組DNA模板為200 ng，特異性引物為Lsp1或Rsp1，簡并引物為AP1-AP4其中之一。第二輪PCR反應(yīng)的擴(kuò)增模板為稀釋50倍的第一輪PCR產(chǎn)物，特異性引物為Lsp2或Rsp2，簡并引物為第一輪所用的AP引物，第三、四輪操作同第二輪，特異引物換成Lsp3/Rsp3或Lsp4/Rsp4，每一輪反應(yīng)的退火溫度詳見表2，擴(kuò)增程序參照試劑盒說明書。最后擴(kuò)增產(chǎn)物于用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，特異擴(kuò)增片段利用DNA膠回收試劑盒回收。連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，送陽性菌株至上海生工測序。

圖1 pNUBG植物表達(dá)載體酶切位點(diǎn)及探針位置Fig.1 Enzyme digestion sites and probe positions of pNUBG plant expression vector

表1 PCR DIG探針制備所用引物Table 1 Primers used for PCR DIG probe preparation

圖2 pNUBG表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)和特異性引物的位置Fig.2 T-DNA structure of pNUBG expression vector and the location of specific primers

表2 巢式PCR反應(yīng)所需要的特異性引物Table 2 Specific primers required for nested PCR reactions

1.2.4 轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17事件特異性PCR檢測及其靈敏度 BCG-17事件特異性PCR檢測的建立：根據(jù)T-DNA左、右側(cè)翼序列的測序結(jié)果以及T-DNA左右端載體序列分別設(shè)計(jì)3對特異性檢測引物：LS132/LA797、LS132/LA791、LS040/LA791和 RS139/RA467、RS139/RA526、RS006/RA467，對轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17進(jìn)行擴(kuò)增，分別篩選一組左、右特異性檢測擴(kuò)增效率最好的，并回收純化特異性片段及測序，比對是否與預(yù)期序列完全一致，最終建立事件特異性檢測方法。特異性檢測引物的一條引物位于甘蔗基因組序列，另一條引物則位于T-DNA左、右端載體序列，引物序列詳見表3。分別利用上述篩選的兩對引物和bar基因引物，以包括BCG-17在內(nèi)的轉(zhuǎn)Cry1Ac-2a-gna基因的不同甘蔗株系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗DNA為模板，表達(dá)載體pUNBG質(zhì)粒為對照，進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測。DNA模板量為200 ng，反應(yīng)循環(huán)數(shù)35，退火溫度見表3。PCR產(chǎn)物取5 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性。

表3 BCG-17事件特異性PCR檢測引物Table 3 Primers for BCG-17 event-Specific PCR detection

檢測轉(zhuǎn)化事件特異性PCR的靈敏度：轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17與受體甘蔗ROC22#的基因組DNA分別稀釋至100 ng/μL，根據(jù)不同的比例配制BCG-17的DNA相對含量為100%、50%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0%（V/V）的總DNA為100 ng/μL的模板樣品。混合樣品取各1 μL作為PCR模板，分別利用上述已篩選出來的擴(kuò)增效率最高的左、右特異性引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢查各濃度BCG-17 DNA模板下的擴(kuò)增效果，測試各對引物的轉(zhuǎn)化事件特異性PCR的特異性和靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17外源T-DNA插入拷貝數(shù)檢測

轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17基因組DNA分別用BamHI、Nde I、EcoRV限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切、電泳和轉(zhuǎn)膜后，利用地高辛標(biāo)記的外源基因BG和bar片段的探針分別進(jìn)行Southern雜交檢測，結(jié)果表明，不同的限制性內(nèi)切酶后的甘蔗基因組DNA經(jīng)BG和bar探針雜交后，均只顯示一條雜交帶，并且雜交帶的大小與預(yù)測理論大小一致（表4），而對照非轉(zhuǎn)基因植株中無雜交信號，說明外源基因已整合到甘蔗BCG-17基因組中并以單拷貝的方式整合（圖3）；用載體骨架序列制備的sta和kan探針進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因甘蔗基因組中沒有來源于轉(zhuǎn)化載體的其他元件的骨架序列。Kpn I酶切后的pNUBG質(zhì)粒經(jīng)BG、sta和kan探針雜交后均顯示一條約11000 bp的雜交帶，而與bar探針雜交則顯示約1800 bp的雜交帶，與預(yù)測理論大小一致（表4）。

表4 BCG-17和pNUBG質(zhì)粒Southern Blot雜交帶大小的理論值Table 4 Theoretical values of Southern Blot hybridization zone size in BCG-17 and pNUBG

圖3 轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17 Southern Blot分析Fig.3 Southern Blot analysis of transgenic sugarcane BCG-17

2.2 外源基因T-DNA左右側(cè)翼序列的獲得及分析

為了獲得BCG-17株系T-DNA的左、右側(cè)翼序列，在T-DNA左右邊界分別設(shè)計(jì)四條巢式特異性引物。左側(cè)四條巢式特異性引物分別與試劑盒中AP1-AP4四條簡并引物組合，經(jīng)過三-四輪熱不對稱巢式PCR反應(yīng)后，電泳結(jié)果顯示，任何引物組合經(jīng)3輪巢式PCR的擴(kuò)增均未獲得特異性片段，只有AP4簡并引物和4條巢式引物組合，經(jīng)過4輪巢式PCR的擴(kuò)增，獲得特異性的片段如圖4-A?；厥债a(chǎn)物送上海生工測序，獲得840 bp的序列，如圖5-A，其中510 bp屬于甘蔗基因組序列，此部分GC百分含量為25.49%；剩余330 bp與T-DNA左邊載體序列重合，并發(fā)現(xiàn)缺失了LB border 最左邊的17 bp序列，見圖5-B。

分離右側(cè)翼序列同操作上，簡并引物AP1與特異性引物Rsp1/Rsp2/Rsp4組合，經(jīng)三輪巢式PCR擴(kuò)增得到特異性片段，如圖4-B。測序獲得1233 bp的序列，如圖6-A。其中915 bp為甘蔗基因組序列，GC百分含量為39.89%，其它318 bp與T-DNA右邊界載體序列重合，并發(fā)現(xiàn)缺失了RB border 最右側(cè)的20 bp，見圖6-B。由此可見，T-DNA序列插入BCG-17基因組時(shí)，左右兩側(cè)的都有不同程度的缺失。

A:左側(cè)翼序列擴(kuò)增；B:右側(cè)翼序列擴(kuò)增。M：DNA Marker；1：1st產(chǎn)物；2：2nd產(chǎn)物3：3rd產(chǎn)物；4：4th產(chǎn)物A: Left flanking sequence.B: Right flanking sequence.M:DNA marker,1: Amplification for 1st, 2: Amplification for 2nd, 3: Amplification for 3rd,4: Amplification for 4th

2.3 建立轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17事件特異性檢測方法

利用左、右側(cè)3對特異性檢測引物L(fēng)S132/LA797、LS132/LA791、LS040/LA791和 RS139/RA467、RS139/RA526、RS006/RA467，對轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增效率最好的引物對分別是LS040/LA791和RS139/RA526，見圖7-A。以轉(zhuǎn)相同基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗株系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗為模板，分別利用LS040/LA791和RS139/RA526特異引物和bar基因引物進(jìn)行事件特異性檢測。結(jié)果顯示，使用特異性檢測引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中，只在轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17可以擴(kuò)增到大小約為750 bp（左側(cè)翼）和約380 bp（右側(cè)翼）的特異性條帶，其他轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因材料擴(kuò)增均為陰性（圖7-C、7-D）；而使用bar基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中，表達(dá)載體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因各株系都能擴(kuò)增到約423 bp的特異性片段，只有非轉(zhuǎn)基因甘蔗擴(kuò)增結(jié)果為陰性（圖7-B）。BCG-17擴(kuò)增到的約750 bp和380 bp的特異性片段回收后，測序，經(jīng)比對證實(shí)與預(yù)期序列完全一致。證明LS040/LA791和RS139/RA526這兩對引物可以特異的識別轉(zhuǎn)基因甘蔗事件BCG-17。

圖5 BCG-17左側(cè)翼序列及拼接位置特征Fig.5 Left flanking sequence of BCG-17 and the character of junction region

圖6 BCG-17右側(cè)翼序列及拼接位置特征Fig.6 Right flanking sequence of BCG-17 and the character of junction region

圖7 甘蔗BCG-17轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測Fig.7 Transformation event-specific PCR detection of the BCG-17 sugarcane

2.4 事件特異性PCR檢測的靈敏度

利用LS040/LA791和RS139/RA526兩對引物檢測在不同BCG-17 DNA含量混合樣品中的轉(zhuǎn)化事件特異性PCR擴(kuò)增效率，測試此兩對引物的最低擴(kuò)增限度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以左側(cè)引物L(fēng)S040/LA791擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)BCG-17的DNA相對含量降低至0.1%時(shí)，仍然可以特異地?cái)U(kuò)增到目的片段（圖8-A）；以右側(cè)引物RS139/RA526擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)BCG-17的DNA相對含量降低至1%、0.5%、0.1%時(shí)，除了目的片段，還出現(xiàn)了非特異片段的擴(kuò)增，當(dāng)降低至0.05%和0%時(shí)，只有非特異片段的擴(kuò)增（圖8-B）。以上結(jié)果表明以右側(cè)RS139/RA526為引物的事件特異性PCR的特異性和靈敏度較差，而以左側(cè)LS040/LA791為引物的事件特異性PCR檢測的特異性好和靈敏度高，最低檢出值達(dá) 0.1%，按甘蔗基因組為10Gb計(jì)算，相當(dāng)于9個(gè)單倍體基因組拷貝數(shù)，也就是說該轉(zhuǎn)化事件特異性PCR最低檢測限約為 9個(gè)單倍體甘蔗基因組拷貝數(shù)。

圖8 左右側(cè)翼特異性引物對PCR檢測限度的測定Fig.8 Limitation of event-specific detection by use of specific primer pairs of left and right flanking sequences

3 討論

目前分離外源T-DNA側(cè)翼序列使用最廣泛的技術(shù)有染色體步移法、高效熱不對稱PCR（hiTAILPCR）和近幾年熱門的全基因組重測序技術(shù)。后者是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析［19］。由此可見，應(yīng)用該技術(shù)的前提條件是已知受體植物的基因組序列信息。到目前為止，國內(nèi)外并未對甘蔗ROC22開展基因組測序工作，因此本實(shí)驗(yàn)仍然選擇操作較為繁瑣的染色體步移法。本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)已知T-DNA左右序列首先設(shè)計(jì)了3條同向Tm值約為65℃的特異性引物，與染色體步移試劑盒中的四條簡并引物分別進(jìn)行熱不對稱 PCR反應(yīng)，經(jīng)過多次三輪巢式PCR反應(yīng)后，電泳檢測仍得不到滿意的實(shí)驗(yàn)效果，故設(shè)計(jì)第四條特異引物。通過簡并引物AP4和T-DNA左側(cè)四條巢式引物組合，經(jīng)過四輪巢式PCR的擴(kuò)增，最終獲得510 bp的T-DNA左側(cè)左側(cè)翼序列。分析此獲得序列的GC百分含量發(fā)現(xiàn)，此部分序列富含A、T堿基，GC含量僅為25.49%。因此推測可能是富含A、T堿基的原因造成大量非特異性片段的擴(kuò)增，三輪巢式PCR得不到特異片段，經(jīng)四輪巢式PCR擴(kuò)增才得到目的片段。而T-DNA右側(cè)翼則在簡并引物AP1與特異性引物Rsp1/Rsp2/Rsp4組合經(jīng)過三輪巢式PCR獲得，由此可見利用染色體步移技術(shù)分離轉(zhuǎn)基因甘蔗T-DNA側(cè)翼序列仍然有一定的難度，推測跟甘蔗是異源多倍體植物并具有龐大復(fù)雜的基因組有關(guān)，所以設(shè)計(jì)嵌套特異性引物時(shí)可以多設(shè)計(jì)幾條備選或進(jìn)行第四輪、五輪巢式PCR。另一方面，在染色體步移試劑盒提供的4種簡并引物里，本次獲得目標(biāo)序列的是AP1與AP4，而在另一個(gè)株系BCG-2則是AP1和AP3，剩下的AP2也曾經(jīng)獲得目標(biāo)片段，只是長度偏短。由此可見，4種簡并引物都是可以用于分離甘蔗已知序列的側(cè)翼序列的。

由于利用TaKaRa公司的 Genome Walking Kit分離轉(zhuǎn)基因甘蔗T-DNA側(cè)翼序列存在較大的難度和工作量，在實(shí)驗(yàn)中，曾嘗試使用了另一種LA PCRTM in vitro Cloning Kit對側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，該方法是依賴酶切連接接頭的染色體步移技術(shù)，理論上該方法的擴(kuò)增目標(biāo)更直接，故特異性會更高，然而在實(shí)驗(yàn)過程中，利用該方法經(jīng)多次嘗試未獲得理想結(jié)果，推測由于甘蔗基因組龐大造成酶切位點(diǎn)分布隨機(jī)造成連接效率偏低，從而引起PCR擴(kuò)增成功率降低。因此不依賴酶切連接的染色體步移是目前較為適合于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因甘蔗T-DNA側(cè)翼序列的方法。

上述獲得的的T-DNA側(cè)翼序列在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)右側(cè)翼序列與高粱BRCA1相關(guān)的結(jié)構(gòu)域蛋白mRNA有39%同源外，而左側(cè)翼序列在數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)任何的同源序列。這個(gè)比對結(jié)果是因?yàn)楦收峄蚪M測序未完成，NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫只有少量的甘蔗轉(zhuǎn)錄組測序和EST序列而造成，因此就目前研究水平，盡管得到了T-DNA的側(cè)翼序列，仍無法對甘蔗BCG-17的T-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的定位。但是甘蔗割手密種AP85-441基因組測序于2018年完成并發(fā)表在Nature Genetics上［20］，本研究團(tuán)隊(duì)曾把序列下載，進(jìn)行本地化建庫獲得庫文件，已獲得的T-DNA側(cè)翼序列經(jīng)Blastn比對發(fā)現(xiàn)， T-DNA插入可能在該基因組的Chr7A非編碼區(qū)19011049、Chr7B非編碼區(qū)20602346、Chr7C非編碼區(qū)9126238和Chr7D非編碼區(qū)12281767位點(diǎn)上。從此結(jié)果看，插入位點(diǎn)可能是在Chr7染色體上，但甘蔗割手密和甘蔗ROC22都是多倍體植物，所以無法判斷T-DNA是插入在A-D中哪一組。而從Southern雜交的結(jié)果看，外源基因是以單拷貝方式插入，所以只能是插入在A-D中其中一組。就目前缺少甘蔗基因組序列數(shù)據(jù)庫的情況下，根據(jù)甘蔗某段核酸序列而進(jìn)行準(zhǔn)確的染色體定位是極其困難的，最好的解決方法是加快甘蔗基因組的測序工作。據(jù)了解，國內(nèi)已經(jīng)有甘蔗研究團(tuán)隊(duì)準(zhǔn)備甘蔗ROC22的基因組測序工作，該項(xiàng)工作的完成，勢必將甘蔗基因組功能研究等基礎(chǔ)研究推上一個(gè)新的臺階。

通過擴(kuò)增T-DNA側(cè)翼序列而建立起來的事件特異性檢測法，是鑒定含有相同T-DNA插入片段的不同轉(zhuǎn)化事件的最有效方法。本研究建立的轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的事件特異性PCR檢測方法特異性好，靈敏度高，轉(zhuǎn)基因成分含量0.1%及以上時(shí)利用常規(guī)定性PCR方法即可檢測，該靈敏度在其他轉(zhuǎn)基因作物事件特異性檢測中普遍存在，如轉(zhuǎn)基因水稻［8，21］、大豆［22］、油菜［23］和玉米［24］等，并且遠(yuǎn)高于歐盟對轉(zhuǎn)基因植物衍生的食品及飼料標(biāo)識的0.9% 的最低限量［25］。

4 結(jié)論

本研究利用southern雜交確定了轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的外源基因的插入拷貝為單拷貝；利用染色體步移方法，擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17外源基因插入位點(diǎn)的左右側(cè)翼序列；以此序列為基礎(chǔ)，建立了轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的事件特異性PCR檢測方法，該方法特異性好，靈敏度高，為轉(zhuǎn)基因甘蔗BCG-17的利用及產(chǎn)品檢測奠定關(guān)鍵技術(shù)基礎(chǔ)。