袁媛 王蕾 石亞偉

（山西大學生物技術研究所 教育部化學生物學與分子工程重點實驗室，太原 030006）

蛋白酶是指能夠將蛋白質降解成小肽和氨基酸的水解酶，占整個工業(yè)酶市場的60%。而堿性蛋白酶為在中性至堿性pH范圍內具有活性的蛋白酶的統(tǒng)稱。1945年，Jaag等［1］最早在地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis中發(fā)現(xiàn)了堿性蛋白酶。微生物蛋白酶大多屬于胞外酶［2］，與動植物相比，微生物來源的堿性蛋白酶具有分離純化過程簡單、生產周期短且產率高的顯著特點［3］。堿性蛋白酶具有較強的耐堿、耐熱能力以及水解蛋白質的活力［4］，主要應用在洗滌劑工業(yè)上，尤其是洗衣和餐具洗滌劑的生產中。堿性蛋白酶的生產菌種和研究對象主要是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）及短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）［5］，如我國目前使用的地衣芽孢桿菌B.licheniformis2709，短小芽孢桿菌B.pumilus 289和209菌株等［6］。產堿性蛋白酶的放線菌較少，主要來源于鏈霉菌［7］。另外，某些霉菌也可以產生堿性蛋白酶。目前，我國堿性蛋白酶研究總體趨勢發(fā)展較好，但國內企業(yè)仍不能實現(xiàn)高端堿性蛋白酶制劑的工業(yè)化生產，主要原因在于國外專利技術的壟斷、國內優(yōu)良的產酶菌株缺乏、酶的單位活力低、洗滌條件下酶的穩(wěn)定性較差等［8-9］。因此，如何提高堿性蛋白酶活力迫在眉睫。

1 產堿性蛋白酶的微生物菌株改造

1.1 傳統(tǒng)菌株誘變改造

這是早期微生物來源堿性蛋白酶研究工作中常用的一種策略，其原理是利用各種物理因素（常用紫外線和低能離子束）和化學試劑處理微生物細胞，使其發(fā)生基因突變，從而引起微生物菌株的遺傳性狀改變進而有利于獲得高產堿性蛋白酶菌株［6］。Wang等［10］應用物理因素紫外線、60Co-γ射線以及化學誘變劑NTG對短小芽孢桿菌B.pumilus BA06進行誘變，得到產酶活力提高4倍的突變菌株SCU11。王曉云等［11］通過對實驗室保藏菌株枯草芽孢桿菌BC2進行紫外誘變后，得到的突變菌株B38的產蛋白酶活性達到最高，相比出發(fā)菌株（27.68 U/mL）提高了3.14倍。王瑾等［12］對芽孢桿菌DL12菌株（酶活力為129.7 U/mL）進行誘變處理，篩選出1株堿性蛋白酶產量高的菌株，酶活力為172.3 U/mL。傳統(tǒng)誘變改造的方法，雖然具有一定的優(yōu)點，但它的弊端也很大，如費時費力、盲目性較大、效率低等。

1.2 太空誘變改造

隨著航天事業(yè)的飛速發(fā)展，太空誘變開始慢慢興起，其原理是利用衛(wèi)星、飛船等將農作物種子或生物菌種帶到太空，使產品因太空中特殊的環(huán)境條件而發(fā)生變異。劉雪等［13］以芝麻香細菌曲為誘變材料，搭乘“神舟十號”飛船進行空間誘變，返回地面后對誘變后麩曲中的細菌進行分離篩選，發(fā)現(xiàn)其中有一株產堿性蛋白酶能力最高的菌株，其酶活力是出發(fā)菌株的6.7倍。

1.3 原生質體融合改造

該技術的方法是利用原生質體的融合實現(xiàn)遺傳重組，從而選育高產堿性蛋白酶菌株。潘延云及其團隊將含有堿性蛋白酶基因的pDW2/ B.subtilis BD105的枯草桿菌工程菌與該基因的出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌B.licheniformis 2709進行原生質體融合，篩選獲得了酶活力最高達到30 778 U/mL的高產堿性蛋白酶的工程菌A16，比出發(fā)菌株高約50%-100%［14］。李宏［15］對芽孢桿菌 SD-142 的原生質體進行誘變處理，篩選到一株堿性蛋白酶酶活為2 759 U/mL的突變株。

1.4 基因工程改造

基因工程技術，主要利用DNA重組的原理，將目的基因插入載體，然后轉入新的宿主細胞，構建成基因重組工程菌。1985年，Jacobs等［16］首次成功克隆到芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因后，利用基因工程技術構建高產蛋白酶工程菌就開始被廣大科學工作者應用，為高產菌株的選育開辟了新路徑［17］。Tang等［18］將來自地衣芽孢桿菌B.licheniformis 2709的堿性蛋白酶基因apr克隆到芽孢桿菌穿梭表達載體pHL中，最終在B.subtilis WB600中表達得到了高表達菌株BW-016，表達量增加了65%。Sareen等［19］將地衣芽孢桿菌B.licheniformis RSP-09-37的堿性蛋白酶基因在大腸桿菌E.coli JM109中進行表達。Lin等［20］成功將地衣芽孢桿菌2709的堿性蛋白酶基因Apr 克隆到表達載體pET-28b（+）中，得到重組質粒pET-28b（+）-Apr。黃磊等［21］將篩選獲得一種高酶活的堿性蛋白酶的編碼基因aprE209克隆入表達質粒pHY-WZX，再轉入枯草桿菌B.subtilis WB600中，得到的重組酶的酶活力達到400 U/mL。利用該種方式構建工程菌的堿性蛋白酶的高產菌株，具有極強的目的性，克服了傳統(tǒng)誘變的盲目性［22］，具有很大的應用潛力。

除了構建基因工程菌的方法，還可以通過基因敲除技術改造表達菌株。傳統(tǒng)的基因編輯方法有同源重組整合載體法、反向篩選標記法和Cre/loxP定點重組法，其中利用同源重組的原理進行靶基因的基因敲除的原理圖，如圖1所示?；蚯贸沁x擇合適的質粒，將靶基因兩邊的同源序列克隆至載體上，轉入宿主菌后利用同源重組的原理實現(xiàn)對靶基因的置換敲除［23］?，F(xiàn)今，CRISPR/Cas9基因編輯方法由于其具有周期短，操作簡單的優(yōu)點，得到人們的青睞。韓登蘭等［24］成功構建了芽孢萌發(fā)缺陷型工程菌枯草芽孢桿菌B.subtilis 168ΔsleBΔcwlJ。劉洋等［25］利用pk18質粒作為自殺質粒并通過同源重組敲除的方式對其進行敲除，證明了NRPS-A與抗菌肽BBL的合成具有直接關系。趙銀娟等［26］利用自殺質粒pMAD，最終獲得不帶抗性且ClpQY完全敲除的枯草芽孢桿菌B.subtilis 3610菌株。Zhou等［27］通過單獨敲除參與孢子形成的調節(jié)基因（spo0A，sigF和sigE），最終發(fā)現(xiàn)ΔsigF的突變體的堿性蛋白酶酶活力相比野生型菌株高出了約19.7%。Zhou等［28］對地衣芽孢桿菌2709的lchAC基因和胞外粘多糖編碼的eps簇敲除，通過篩選不同模塊質粒和基因組位點之間最有效的表達系統(tǒng)，進一步優(yōu)化了堿性蛋白酶基因（aprE）的表達。由于淀粉酶和幾丁質酶是兩種在宿主菌株中分泌量相對較高的天然細胞外蛋白，可阻礙堿性蛋白酶的分泌和表達，所以Zhou等［29］基于CRISPR/Cas9開發(fā)了一種高效的地衣芽孢桿菌基因組編輯系統(tǒng)將以上兩種酶的基因敲除，結果表明，在兩個基因均缺失的突變體中有效地提高了堿性蛋白酶的產量。近幾年，CRISPR/Cas9在實驗中的應用越來越廣泛，很多課題組也在以此為基礎不斷的創(chuàng)新，相信未來的發(fā)展前景會更好。

圖1 同源重組法基因敲除原理圖Fig.1 Schematic mechanisms of gene knockout using homologous recombination

2 利用蛋白質工程提升堿性蛋白酶活性

在過去的30年中，蛋白質工程已經成為開發(fā)提升酶活性的重要工具。當前利用蛋白質工程技術對堿性蛋白酶的改造主要集中在提高其熱穩(wěn)定性、抗氧化性以及專一性等的研究中。Jaouadi等［30］通過蛋白質工程發(fā)現(xiàn)5個氨基酸：Leu31、Thr33、Asn99、Phe159和Gly182對短小芽孢桿菌B.pumilus 的SAPB的酶活性有重要影響，通過定點誘變構建了12個突變體，結果發(fā)現(xiàn)，三重突變體L31I/T33S/N99Y的比活最高，大約為野生型酶的2倍。Li等［31］通過對其N末端序列-1和-2處位置進行定點誘變，以提高鏈霉菌角蛋白酶Sfp2的表達水平，最終發(fā)現(xiàn)L（-1）F突變體（48 935 U/mg）的比活性是野生型Sfp2的9倍。石亞偉等［32］利用蛋白質工程技術，對PB92枯草桿菌蛋白酶進行改造，獲得A188P+V262I堿性蛋白酶突變體，相比野生型，其熱穩(wěn)定性以及耐堿性均有明顯提高，在兩種洗滌劑體系（STPP體系和MGDA體系）進行評價，發(fā)現(xiàn)在不加任何保護劑和穩(wěn)定劑的前提下，突變體相比親本酶具有更優(yōu)良的穩(wěn)定性和洗滌性能。蛋白質工程技術出現(xiàn)至今已近40年，各項技術手段日漸成熟，結合大量的蛋白酶空間結構的揭示，進一步為利用在基因水平上通過氨基酸突變，提升蛋白酶的活性成為提升蛋白酶活力的重要手段。

3 通過優(yōu)化啟動子或信號肽的方式提升堿性蛋白酶的表達量

啟動子作為轉錄水平調控中的關鍵元件，而信號肽是翻譯階段的重要元件，在這二者的基礎上進行改造，對于蛋白酶表達調控是一種很好的策略。如Liu等［33］使用最佳表達系統(tǒng)（信號肽DacBSP和雙啟動子PBsamy-PBaamy）的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)以評估堿性蛋白酶的表達水平發(fā)現(xiàn)，在56 h的峰值為27 860 U/mL。Guan等［34］通過應用半理性啟動子工程方法，構建了包含單啟動子和雙啟動子的一系列表達質粒，發(fā)現(xiàn)雙啟動子PgsiB-PHpaII表現(xiàn)最佳。

啟動子改造方面主要有通過啟動子替換、串聯(lián)啟動子或不同啟動子組合調控蛋白酶的表達，另外也可通過對啟動子進行定點突變來調控蛋白酶的表達。史超碩等［35］分析解淀粉芽孢桿菌的 α -淀粉酶啟動子P1、枯草芽孢桿菌的 α-淀粉酶啟動子P2及啟動子組合P-1-2、P-2-1對克勞氏芽孢桿菌的堿性蛋白酶aprE表達的影響，結果表明，發(fā)酵48 h后，雙啟動子重組菌枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600/P-2-1-aprE表達的酶活性最高，達到了6 125 U/mL。楊春暉等［36］先通過基因克隆技術得到了短小芽孢桿菌B.pumilus的堿性蛋白酶基因的啟動子片段，將其插入到穿梭質粒載體pSUGV4中，分別轉入枯草芽孢桿菌B.subtilis和短小芽孢桿菌B.pumilus中進行表達，得到的堿性蛋白酶活性分別為466.5 U/mL和3 060 U/mL。

堿性蛋白酶生產菌株大多使用一般分泌（Sec）途徑將蛋白質分泌到培養(yǎng)基中。所有分泌蛋白的一個共同特征就是它們的N端含有信號肽（signal peptide，SP），它們是之所以被分泌的重要識別位點。Degering等［37］構建了由220種地衣芽孢桿菌B.licheniformis的信號肽（稱為異源SP）和173種枯草芽孢桿菌B.subtilis的信號肽（稱為同源SP）組成的信號肽文庫發(fā)現(xiàn)，來源于地衣芽孢桿菌B.licheniformis幾丁質酶的信號肽dBli00338可以使堿性蛋白酶在枯草芽孢桿菌B.subtilis TEB1020中活性提高6-7倍。

在啟動子和信號肽這些調控元件水平上對微生物堿性蛋白酶進行研究，也是目前在微生物堿性蛋白酶領域的熱門研究方向。通過單獨替換啟動子、信號肽或將兩者進行組合，比較分析不同啟動子或信號肽對堿性蛋白酶的表達情況，選出最優(yōu)方案，從而提高了微生物堿性蛋白酶的酶活力。

4 展望

隨著對環(huán)境保護的日益重視，生物催化劑的使用越來越受到關注。微生物來源堿性蛋白酶在洗滌劑行業(yè)廣泛應用是減少化學洗滌劑的不二選擇。目前堿性蛋白酶仍然不能滿足工業(yè)對多品種生產的增長需求，特別是在液體洗滌市場，我們需要面對的挑戰(zhàn)包括酶產量低、酶活力低、穩(wěn)定性差以及生產成本高等問題。除此之外，還需對堿性蛋白酶生產過程精確控制，特別是簡化堿性蛋白酶的下游純化工藝尤為重要。近年來合成生物學成為學科發(fā)展的一個新的熱點，通過人工染色體構建、地盤細胞設計、全局轉錄調控等有望應用于堿性蛋白酶生產相關的多基因表達的調控［38］，加之開發(fā)更多便捷高效的芽孢桿菌基因編輯技術等有望獲得人們理想的蛋白酶。但蛋白酶產品的實現(xiàn)，在酶制劑的發(fā)酵、分離純化、穩(wěn)定性方面仍然有賴于經典的蛋白類產品的發(fā)酵和提純工藝的進步［39］。如何保持酶的高濃度、高純度、高穩(wěn)定性等，特別是在洗滌劑中的穩(wěn)定，都是堿性蛋白酶活力提升繞不開的技術難題。不論采用何種途徑提高堿性蛋白酶的酶活力，都有望擴大其在生物技術領域和工業(yè)領域中的應用。