陳曉雨 張建 張新亞 唐雨婷 邵鈺晨 羅志丹 盧辰

（1.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院（連云港），連云港 222005）

Tth DNA聚合酶是一種從嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）分離得到的耐熱DNA聚合酶［1］。與同樣來(lái)源于棲熱菌屬的Taq DNA聚合酶不同，在僅有Mg2+存在時(shí)，Tth DNA聚合酶表現(xiàn)出一般的DNA聚合酶活性；但還有Mn2+存在條件下，該酶同時(shí)具有耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶的活性［2］。因此自1990年發(fā)現(xiàn)Tth DNA聚合酶后，研究者很快將其嘗試用于丙型肝炎、流感病毒等RNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR檢測(cè)［3-5］。更重要的是，Tth DNA聚合酶對(duì)于血液、肌肉等生物組織中含有的PCR抑制成分具有較強(qiáng)的耐受性［6-7］，十分適合用于粗樣本快速檢測(cè)［8］。然而，野生型Tth DNA聚合酶存在比活力低［9-10］、熱穩(wěn)定性不如Taq DNA聚合酶［11］、Mn2+影響PCR擴(kuò)增保真性［12］等缺陷，阻礙了其廣泛應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，研究者開(kāi)始重新審視Tth DNA聚合酶的改造和應(yīng)用［13-15］。在此過(guò)程中，如何快速準(zhǔn)確測(cè)定Tth DNA聚合酶的活性，是準(zhǔn)確評(píng)估蛋白質(zhì)改造和生產(chǎn)工藝優(yōu)化效果的前提。目前測(cè)定DNA聚合酶活力的方法主要有：（1）同位素標(biāo)記法，利用同位素3H標(biāo)記的dNTP，把30分鐘內(nèi)在最適反應(yīng)溫度下將10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量定義為1個(gè)活力單位（U），該方法最為準(zhǔn)確，也是國(guó)內(nèi)外主流廠商約定俗成的DNA聚合酶活力定義標(biāo)準(zhǔn)。但受限于同位素操作資質(zhì)與放射性防護(hù)條件，很難在普通實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)。（2）瓊脂糖凝膠電泳或熒光定量PCR法，使用已標(biāo)定酶活的對(duì)照品與樣品擴(kuò)增同樣的模板，通過(guò)比較產(chǎn)物凝膠電泳條帶亮度或熒光定量PCR的Ct值來(lái)計(jì)算樣品活性相對(duì)于對(duì)照品的倍數(shù)。這兩種方法只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，耗時(shí)長(zhǎng)，且受對(duì)照品批次間活力標(biāo)定不穩(wěn)定因素影響較大，重復(fù)性差，靈敏度低。（3）熒光染料法。2018年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布了《Taq DNA聚合酶》的推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［16］，其中酶活檢測(cè)采用了與同位素法類(lèi)似的等溫聚合反應(yīng)，但最后使用雙鏈特異性的熒光染料PicoGreen來(lái)定量測(cè)定新生成的雙鏈DNA，避免了使用同位素。然而，該方法在74℃下直接測(cè)定雙鏈產(chǎn)物的熒光值，忽略了此溫度下產(chǎn)物中的雙鏈大多數(shù)呈解鏈狀態(tài)，使用雙鏈特異性染料測(cè)得的熒光值根本無(wú)法反映真實(shí)的產(chǎn)物量，導(dǎo)致該標(biāo)準(zhǔn)并未被廣泛采納。此外，還有其他一些利用熒光標(biāo)記探針的方法［17-19］，但探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，熒光標(biāo)記價(jià)格昂貴，且標(biāo)記基團(tuán)可能會(huì)影響聚合酶活性，也未能得到廣泛應(yīng)用。

本研究對(duì)國(guó)標(biāo)所采用的熒光染料法進(jìn)行了大幅改進(jìn)，重新設(shè)計(jì)了標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和DNA雙鏈產(chǎn)物量測(cè)定方式，期望建立一種準(zhǔn)確度更高、重復(fù)性更好的Tth DNA聚合酶活性測(cè)定方法，并可以推廣到其他DNA聚合酶，助推生物工具酶的研發(fā)與改造。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 rTth DNA聚合酶（5 U/μL）：東洋紡（上海）生物科技有限公司；PicoGreen染料：蘇州宇恒生物科技有限公司；dNTP混合液（2.5 mmol/L each）：江蘇愚公生命科技有限公司；SYBR Green I染料：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。TE緩沖液（pH 8.9）配方：10 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA，pH 8.9（25℃）。野生型Tth蛋白與I640F突變體蛋白：本課題組自行重組表達(dá)。

1.1.2 儀器設(shè)備 Qubit 4熒光計(jì)：Thermo Fisher Scientific公司；Synteny Neo2多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；LightCycler480 II熒光定量PCR儀：瑞士羅氏集團(tuán)；恒溫金屬?。汉贾菝讱W儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探針設(shè)計(jì)與合成 起始探針H1為一段寡聚脫氧核苷酸，包括16 bp的配對(duì)區(qū)和5′端25 nt的單鏈區(qū)。該探針可自行形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其3′配對(duì)區(qū)作為引物，以5′端未配對(duì)的25 nt單鏈區(qū)為模板，加入DNA聚合酶和dNTP后即可進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)，從而形成完整的41 bp配對(duì)，產(chǎn)物命名為H2（圖1）。委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成H1和H2樣品。

圖1 發(fā)夾型探針示意圖Fig.1 Hairpin probe

1.2.2 H2含量與熒光增加值的線性關(guān)系 使用Qubit 4 熒光計(jì)精確測(cè)定所合成的H1和H2兩種探針的雙鏈配對(duì)區(qū)域濃度（ng/μL），根據(jù)H1和H2的配對(duì)區(qū)核苷酸序列，使用在線工具（http：//www.endmemo.com/）換算成摩爾濃度。然后用TE緩沖液（調(diào)整到 Tth聚合酶最適pH 8.9）將H1和H2均稀釋為 0.4 μmol/L、0.6 μmol/L 和 0.8 μmol/L 三組。每組相同摩爾濃度的H1和H2溶液，再與PicoGreen染料和TE緩沖液按表1所示不同比例混合，配制成100 μL（此體積為酶標(biāo)儀可準(zhǔn)確檢測(cè)的最小體積）的探針工作溶液，每種比例設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

將上述6種工作溶液放入多功能酶標(biāo)儀中，在30℃下，以480 nm波長(zhǎng)激發(fā)，520 nm發(fā)射測(cè)定熒光值。將每個(gè)比例工作溶液測(cè)得的熒光值，減去僅含H1探針工作溶液的熒光值，得到含有不同濃度H2探針工作溶液的熒光增加值。然后以100 μL工作溶液中H2探針含量（單位pmol）為橫坐標(biāo)，熒光增加值為縱坐標(biāo)，使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行線性回歸，驗(yàn)證H2探針含量與熒光增加值之間的線性關(guān)系及線性范圍。取線性關(guān)系較好的一組為標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，并以該濃度H1溶液作為后續(xù)酶活測(cè)定的底物溶液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線探針工作溶液配方Table 1 Probe working solution formulations for standard curve

1.2.3 酶活測(cè)定及飽和度實(shí)驗(yàn) 將商業(yè)化rTth DNA聚合酶原液稀釋500、1 000、2 000、4 000和8 000倍，分別配制表2的酶活測(cè)定反應(yīng)體系，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。同時(shí)配制不加酶液的陰性對(duì)照。

表2 Tth DNA聚合酶活性檢測(cè)反應(yīng)體系Table 2 Reaction system for Tth DNA polymerase activity assay

國(guó)際上通行的Tth聚合酶1個(gè)活力單位（U）定義為30 min內(nèi)在74℃下將10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量。因此將配好的反應(yīng)溶液在74℃下分別孵育5 min、15 min和30 min后，加入1 μL 0.5 mol/L EDTA溶液終止反應(yīng)。然后緩慢冷卻到室溫使產(chǎn)物退火復(fù)性為雙鏈，加入0.5 μL PicoGreen染料，再用TE緩沖液（pH 8.9）稀釋到100 μL，放入酶標(biāo)儀在30℃下測(cè)定熒光值。用反應(yīng)后溶液相對(duì)不加酶液陰性對(duì)照的熒光增加值，與反應(yīng)時(shí)間作圖。如果某個(gè)稀釋倍數(shù)下，熒光增加值與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系，則可將反應(yīng)30 min后的熒光增加值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算出100 μL反應(yīng)體系中產(chǎn)物H2的含量（pmol），按下式計(jì)算得到原酶液活力：

原酶液活力（U/μL）=（30 min產(chǎn)物量（pmol）×25 × 稀釋倍數(shù)）/ 10000

熒光增加值與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系的稀釋倍數(shù)區(qū)間所對(duì)應(yīng)的稀釋液酶活，即為本方法的定量范圍。

1.2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證 取本實(shí)驗(yàn)自行重組表達(dá)獲得的Tth DNA聚合酶野生型蛋白（1.57 mg/mL，純度＞90%）和I640F突變體蛋白（1.48 mg/mL，純度＞90%），均稀釋200、500和1 000倍后，采用上述方法測(cè)定原液酶活。然后使用商業(yè)化rTth、重組表達(dá)野生型Tth和I640F突變體3種原酶液，以同樣濃度的pUC18質(zhì)粒為模板，使用相同引物（引物序列為 F：5′-AGTGGGTTACATCGAACTGGATCTC-3′，R ：5′-GCACTGCATAATTCTCTTACTGTCA-3′），采用SYBR Green I染料法按相同程序進(jìn)行熒光定量PCR。將3種酶液對(duì)應(yīng)的Ct值差值換算為產(chǎn)物量相對(duì)倍數(shù)，與本方法測(cè)得的活力進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 核酸產(chǎn)物與熒光增加值的線性關(guān)系

根據(jù)PicoGreen熒光染料說(shuō)明書(shū)，該染料對(duì)雙鏈核酸的結(jié)合力是單鏈的1 000倍以上，且當(dāng)雙鏈核酸濃度在1 ng/μL以下時(shí)，受激產(chǎn)生的熒光值與堿基對(duì)數(shù)量成正比。本研究首先使用總摩爾數(shù)相同但比例不同的H1與H2混合，模擬H1不斷反應(yīng)生成H2的過(guò)程，該混合液相對(duì)僅含H1溶液的熒光增加值，理論上應(yīng)當(dāng)與H2相對(duì)H1增加的25 bp配對(duì)區(qū)（圖1）的摩爾濃度之間存在良好的線性，但線性范圍需要摸索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)實(shí)際配制的H1、H2母液濃度為0.43 μmol/L，對(duì)應(yīng)100 μL工作液中H2探針雙鏈部分最高濃度為1.15 ng /μL時(shí)，H2含量與熒光增加值之間存在良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2達(dá)到0.99以上，且3次重復(fù)測(cè)定間的偏差較?。▓D2）。而探針母液濃度達(dá)到0.6 μmol/L以上（對(duì)應(yīng)工作液中H2探針雙鏈部分最高濃度為1.5 ng /μL以上）時(shí)，線性關(guān)系較差。

圖2 熒光增加值與H2含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of fluorescence intensity added and H2 content

2.2 Tth DNA聚合酶活性測(cè)定及定量范圍

將原酶液稀釋500倍和1 000倍后，反應(yīng)5 min、15 min和30 min時(shí)的熒光增加值之間已明顯不呈線性關(guān)系，不能用于測(cè)定酶活；而稀釋2 000倍和4 000倍后，不同反應(yīng)時(shí)間熒光增加值之間線性關(guān)系良好（圖3），因此可以選擇這兩個(gè)稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算酶液活力。

圖3 不同稀釋倍數(shù)的rTth聚合酶在不同反應(yīng)時(shí)間下的熒光增加值Fig.3 Fluorescence intensity added of rTth polymerase with different dilution ratios at different reaction times

由表3可知，稀釋2 000倍后測(cè)得的原酶液酶活為5.48 U/μL，稀釋4 000倍后測(cè)得的原酶液酶活為5.31 U/μL。考慮到酶液生產(chǎn)廠商在分裝時(shí)一般會(huì)在標(biāo)定值基礎(chǔ)上給予10%-20%左右的冗余，可以認(rèn)為本方法測(cè)定的結(jié)果與標(biāo)定值相符。而當(dāng)將原酶液進(jìn)一步稀釋8 000倍后，熒光增加值與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系變得紊亂。因此認(rèn)為本方法可以定量的稀釋液酶活范圍是 1.33×10-3-2.74×10-3U/μL。

2.3 熒光定量PCR驗(yàn)證酶活

將本課題組重組表達(dá)獲得的野生型Tth DNA聚合酶蛋白和I640F突變體蛋白均稀釋200、500和1 000倍，使用上述方法測(cè)定酶活。結(jié)果表明200倍稀釋后兩種蛋白的熒光增加值與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系（圖4-A，4-B），計(jì)算得到的原液酶活分別為0.27 U/μL 和 0.57 U/μL。

表3 商業(yè)化Tth DNA聚合酶活性測(cè)試結(jié)果Table 3 Results of commercial Tth DNA polymerase activity assay

然后使用商業(yè)化rTth、自主表達(dá)野生型Tth和I640F突變體三種原酶液對(duì)相同的pUC18質(zhì)粒模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，野生型Tth DNA聚合酶得到的Ct值，與商業(yè)化rTth的Ct值相差4.28個(gè)循環(huán)，而與I640F突變體相差0.99個(gè)循環(huán)（圖4-C，表4）。折算成產(chǎn)物量可知，使用相同模板進(jìn)行PCR后，野生型Tth獲得的產(chǎn)物量是商業(yè)化rTth的1/19.4，是I640F突變體的1/2，與本方法測(cè)得的酶活比例相符，表明本方法測(cè)得的酶活可以反映真實(shí)使用環(huán)境下的Tth DNA聚合酶活性。

圖4 重組表達(dá)Tth野生型與突變體蛋白的酶活測(cè)定與熒光定量PCR驗(yàn)證Fig.4 Activity assay and fluorescence quantitative PCR validation of recombinant WT Tth and its mutant polymerase

3 討論

本研究建立的酶活測(cè)定方法與現(xiàn)有方法相比體現(xiàn)出3個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）無(wú)需同位素即可實(shí)現(xiàn)對(duì)Tth DNA聚合酶活性的絕對(duì)定量。已有研究證明，PicoGreen染料與產(chǎn)物雙鏈DNA結(jié)合激發(fā)的熒光值，與3H同位素標(biāo)記所測(cè)得的dNTP摻入量有很好的相關(guān)性［20］，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明本方法測(cè)得結(jié)果與商業(yè)化標(biāo)定酶活一致，完全可以取代同位素。（2）利用未進(jìn)行聚合反應(yīng)之前的發(fā)夾型底物H1和發(fā)生聚合反應(yīng)之后生成的產(chǎn)物H2，以一定的比例混合來(lái)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，最大程度模擬了聚合反應(yīng)開(kāi)始后的H1不斷消耗生成H2的動(dòng)態(tài)變化，使標(biāo)準(zhǔn)曲線更真實(shí)地反映了酶活測(cè)定反應(yīng)體系中的實(shí)際情況。本研究所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上，重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間偏差小，表明本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度和重復(fù)性都比較理想。（3）反應(yīng)30 min后不在74℃下直接測(cè)定熒光值，而是終止反應(yīng)后將溫度降至30℃，使高溫下大部分解鏈的雙鏈重新退火形成完整雙鏈，測(cè)得的熒光值才能真實(shí)反映雙鏈產(chǎn)物的含量。本方法不僅可以用于Tth DNA聚合酶的活力測(cè)定，也可以推廣到Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等不具備3′-5′外切酶活性的各類(lèi)DNA聚合酶活性測(cè)定。

表4 測(cè)得酶活與熒光定量PCR Ct值對(duì)比Table 4 Comparison of measured enzyme activity and fluorescence quantitative PCR Ct values

由于PicoGreen染料的熒光值與雙鏈DNA配對(duì)數(shù)僅在一定范圍內(nèi)體現(xiàn)出良好的線性（官方標(biāo)稱(chēng)線性范圍是 1 pg/μL - 1 ng/μL，本研究實(shí)測(cè)在 1.5 ng/μL以上線性較差），故而測(cè)試反應(yīng)體系中H1底物濃度不可太高。而在酶活測(cè)定過(guò)程中，要求底物在反應(yīng)到30 min時(shí)仍然是過(guò)量的，因此本方法初步驗(yàn)證得到的定量限，即加入反應(yīng)體系的酶濃度一般應(yīng)在1.33× 10-3- 2.74 × 10-3U/μL之間。這一方面表明本方法靈敏度極高；另一方面對(duì)于未知樣品，則需要多次嘗試高倍數(shù)梯度稀釋才能獲得較理想的結(jié)果。未來(lái)將進(jìn)一步優(yōu)化以擴(kuò)展該方法的測(cè)量范圍。

4 結(jié)論

利用一種高靈敏度雙鏈特異性核酸染料PicoGreen和發(fā)夾型探針底物，建立了一種終點(diǎn)法測(cè)定Tth DNA聚合酶活性的方法。該方法不依賴(lài)同位素，可實(shí)現(xiàn)以Tth DNA聚合酶為代表的DNA聚合酶活性的精確測(cè)定。