瞿歡 李成 陳汭 廖藝杰 曹三杰，2，3 文翼平 顏其貴 黃小波，2，3

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，成都 611130）

豬 δ冠 狀 病 毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）是一種新型豬腸道冠狀病毒，主要引起哺乳仔豬嘔吐、腹瀉脫水和死亡［1］。2012年 Woo等［2］用全基因組測(cè)序首次報(bào)道了PDCoV的存在。2014年，PDCoV在美國(guó)豬群快速傳播流行，成為感染普遍的腹瀉病原［3-4］。至今，PDCoV已在全球多個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)（加拿大［5］、中國(guó)［6］、韓國(guó)［7］、泰國(guó)［8］、日本［9］等）被報(bào)道?；厮菡{(diào)查發(fā)現(xiàn)，PDCoV最早在2004年我國(guó)豬腹瀉樣本中就已經(jīng)存在［10］。目前，我國(guó)大部分省份均存在PDCoV感染，且與其他豬腸道病原共感染的現(xiàn)象也較普遍［10-12］。

PDCoV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒［13］，基因組3′端主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，依次包括表面纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）［14］。Shang等［15］用冷凍電鏡技術(shù)解析了S蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能：S蛋白由非共價(jià)連接的S1、S2兩部分組成，S1包含N末端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C末端結(jié)構(gòu)域（CTD），兩者都能夠作為受體結(jié)合區(qū)域（receptor bingding domain，RBDs），而S1-CTD被認(rèn)為是主要的RBD，并被證實(shí)是優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)［16］；S2能介導(dǎo)宿主和病毒的膜融合。其他冠狀病毒的研究表明S是最早刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白［17-18］。Carvajal等［19］發(fā)現(xiàn)感染豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的豬血清中S蛋白抗體比N蛋白抗體更持久，因此S蛋白有最佳的抗原性。

目前對(duì)于PDCoV主要包括病原學(xué)和血清學(xué)診斷。病原學(xué)診斷方法如RT-PCR、原位雜交、電鏡、免疫組化等不適合大規(guī)模疫病普查。血清學(xué)診斷方法如病毒中和試驗(yàn)（VNT）、間接免疫熒光（IFA）操作繁瑣，因此ELISA具有相對(duì)更獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Su等［20］、楊浩等［21］以原核表達(dá)的 N 蛋白建立了間接ELISA，證實(shí)該方法的敏感性和特異性高。此外，Luo等［22］用建立的重組M蛋白間接ELISA，檢測(cè)了河北省的流行情況。

隨著PDCoV的流行，該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的影響將進(jìn)一步加劇，疫苗的研究和應(yīng)用將是控制該病的趨勢(shì)，因此免疫抗體的評(píng)價(jià)具有重要的應(yīng)用前景。目前基于N、M、S蛋白的ELISA抗體檢測(cè)方法均有局限性，N、M相對(duì)保守但與疫苗保護(hù)相關(guān)性不大。S是誘導(dǎo)中和保護(hù)抗體的重要結(jié)構(gòu)蛋白，產(chǎn)生的抗體更適合做免疫相關(guān)性評(píng)價(jià)，但全長(zhǎng)太大，同時(shí)存在糖基化修飾而影響原核表達(dá)效果。本研究根據(jù)S基因生物信息學(xué)和前期結(jié)果［16］，截短表達(dá)了含中和抗原表位的S1-CTD區(qū)域，建立了檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法，旨在為PDCoV的血清學(xué)調(diào)查和免疫抗體檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、表達(dá)載體及血清 PDCoV四川分離株CHN-SC2015（GenBank收錄號(hào)：MK355396.1），表達(dá)載體pET28a（+），由本實(shí)驗(yàn)室保存。豬PDCoV陽(yáng)性高免血清，豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、乙型腦炎病毒（JEV）、豬輪狀病毒（PoRV）、PEDV、TGEV等陽(yáng)性血清，由本實(shí)驗(yàn)室提供。490份臨床血清樣品，采集自2012-2017年四川地區(qū)。JEV pET-28a-E、PDCoV pET-28a-N 蛋白由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 PrimeScript RT reagent Kit、EcoRI、HindⅢ、T4 DNA ligase購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（DP204）購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；HRP-兔抗豬IgG、總RNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 S1-CTD基因片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 參照CHN-SC2015株 S基因序列，針對(duì)含抗原表位區(qū)域S1-CTD（S基因的832-1 848 bp）設(shè)計(jì)引物（5′- CGGAATTCATGGATGGGTTCTACTCCGAC-3′/5′-CCAAGCTTTGAGGTGTATTGTGCCAGT -3′）。進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為98℃ 5 min；98℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 40 s， 共 34個(gè) 循 環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與 pET28a載體進(jìn)行雙酶切（EcoRⅠ和Hind Ⅲ），構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-S1CTD，經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定（圖1）。

圖1 pET28a-S1-CTD構(gòu)建流程圖Fig.1 Construction process of pET28a-S1-CTD

1.2.2 S1-CTD重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 質(zhì)粒pET28a-S1-CTD和空載分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）中，IPTG 37℃誘導(dǎo)12 h，SDS-PAGE分析表達(dá)情況。包涵體溶解后，Ni+柱純化蛋白，按照包涵體蛋白液與透析緩沖液體積1∶50比例依次用含不同尿素濃度的復(fù)性緩沖液透析復(fù)性6 h；以1∶250稀釋的豬抗PDCoV陽(yáng)性血清為一抗，以1∶5 000倍稀釋的兔抗豬IgG-HRP為二抗進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.3 間接ELISA最佳條件的篩選 用方陣滴定法確定反應(yīng)最佳條件。S1-CTD蛋白倍比稀釋為 16-0.5 μg/100 μL；抗PDCoV 豬陽(yáng)性和陰性血清倍比稀釋至 1∶50-1∶800；抗原包被條件分別在 4℃過(guò)夜，37℃ 2 h，37℃ 1 h；采用 1% BSA、2% BSA、1%脫脂牛奶、5%脫脂牛奶作為封閉液；待檢血清37℃孵育0.5、1、1.5和2 h；兔抗豬 IgG-HRP作1∶2 500-1∶10 000稀釋，作用0.5、1、1.5 h；37℃顯色5、15、30 min。陽(yáng)性與陰性O(shè)D450nm比值（P/N）最大時(shí)，確定該方法的最佳反應(yīng)條件。

1.2.4 間接ELISA臨界值的確定 檢測(cè)40份PDCoV陰性血清，計(jì)算樣品OD450nm值的平均數(shù)（）和標(biāo)準(zhǔn)方差（S D），當(dāng)OD450nm≥+3SD判定為陽(yáng)性，當(dāng)OD450nm≤+2SD時(shí)，可判定為陰性。介于二者之間為可疑需重測(cè)。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 用間接ELISA檢測(cè)CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV等陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)立PDCoV陰陽(yáng)性血清對(duì)照，評(píng)估該方法的特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：隨機(jī)取7份未知臨床血清樣品，使用同批次的酶標(biāo)板，檢測(cè)5次。批間重復(fù)性試驗(yàn)：用5個(gè)不同批次蛋白包被的酶標(biāo)板，同時(shí)檢測(cè)7份不同的血清樣品。計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)，以檢測(cè)其重復(fù)性。

1.2.7 符合率的測(cè)定 隨機(jī)選取PDCoV陰陽(yáng)性血清樣本30份，分別用間接ELISA和VNT［23］檢測(cè)，VNT試驗(yàn)中血清抗體效價(jià)≥1∶4時(shí)判定為陽(yáng)性，否則為陰性，計(jì)算兩種方法的符合率。

1.2.8 間接ELISA的初步應(yīng)用 取2012-2017年從四川收集的490份豬血清樣本，用ELISA進(jìn)行PDCoV感染的血清學(xué)調(diào)查，了解該病在四川豬群的流行情況。

2 結(jié)果

2.1 S1-CTD基因原核表達(dá)載體的鑒定

重組表達(dá)載體pET28a-S1-CTD經(jīng)RT-PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果顯示均得到大小約1 000 bp的條帶，與預(yù)期相符（圖2）。測(cè)序結(jié)果也證實(shí)pET28a-S1-CTD構(gòu)建成功。

2.2 S1-CTD重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

取含質(zhì)粒pET28a-S1-CTD的表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE顯示重組蛋白大小約41 kD，空載表達(dá)菌誘導(dǎo)無(wú)目的蛋白表達(dá)，說(shuō)明重組蛋白S1-CTD表達(dá)成功（圖3-A）。電泳顯示目的蛋白主要以包涵體存在，收集包涵體洗滌兩次并溶解，經(jīng)親和層析純化，得到約41 kD的目的蛋白（圖3-B）。Western blot顯示重組蛋白與豬抗PDCoV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖3-C）。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-S1CTD的PCR（A）及雙酶切鑒定（B）Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-S1CTD by PCR (A) and double digestion (B)

2.3 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的篩選

基于S1-CTD蛋白為抗原的間接ELISA，經(jīng)方陣滴定確定了最佳條件如下：1 μg/100 μL 的S1-CTD蛋白37℃包被2 h，用2%BSA在37℃封閉1.5 h；血清最佳稀釋度為1∶50，在37℃反應(yīng)1 h；兔抗豬IgG-HRP抗體以1∶5 000稀釋在37℃下作用0.5 h，TMB在37℃顯色15 min。

2.4 間接ELISA臨界值的確定

2.5 特異性試驗(yàn)

用建立好的ELISA檢測(cè)CSFV、PRRSV、PCV、PRV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV的陽(yáng)性血清，設(shè)PDCoV陰性和陽(yáng)性血清為對(duì)照。結(jié)果顯示PDCoV陽(yáng)性血清OD450nm值為0.932，而檢測(cè)PDCoV的陰性血清與8種常見(jiàn)豬病毒的陽(yáng)性血清OD450nm值均小于0.377，表明該方法與其他病毒陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好（圖5）。

圖3 重組蛋白S1-CTD的SDS-PAGE與Western blot分析Fig.3 The SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant S1-CTD protein

圖4 臨界值的測(cè)定Fig.4 Determination of the cut-off value

圖5 間接ELISA的特異性試驗(yàn)Fig.5 Specificity of the indirect ELISA

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

ELISA重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在2.65%-9.57%，批間變異系數(shù)在6.01%-9.98%，兩者均小于10%，表明該方法重復(fù)性較好（表1）。

表1 間接ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Repeatability of the indirect ELISA

2.7 符合率試驗(yàn)

用間接ELISA和VNT試驗(yàn)檢測(cè)隨機(jī)選取的30份血清樣品，結(jié)果表明，間接ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性率為 40%（12/30），陰性率為 60%（18/30）；VNT試驗(yàn)的陽(yáng)性率為36.7%（11/30），陰性率為63.3%（19/30）；兩者間陽(yáng)性符合率為81.8%（9/11），陰性符合率為84.2%（16/19），總符合率為83.3%（25/30）（表2）。

表2 間接ELISA與VNT對(duì)血清樣品的比較性檢測(cè)Table 2 Comparative detection of serum samples by indirect ELISA and VNT

2.8 ELISA的初步應(yīng)用結(jié)果

用間接ELISA檢測(cè)2012-2017年收集的四川地區(qū)490份豬血清樣品，結(jié)果顯示PDCoV總陽(yáng)性率為（241/490）49.18%，其中在達(dá)州、宜賓、阿壩、巴中部分豬場(chǎng)的陽(yáng)性率高達(dá)93.33%-100%，可見(jiàn)PDCoV在這些地區(qū)呈地方性流行（表3）。

3 討論

豬δ冠狀病毒是一種新的豬腸道冠狀病毒，該病的診斷方法尚不成熟，因此建立一種簡(jiǎn)單、特異、靈敏的抗體檢測(cè)方法對(duì)該病的診斷和監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義［24］。本研究在前期曾嘗試表達(dá)完整S蛋白，但表達(dá)效果不理想，經(jīng)過(guò)S基因生物信息學(xué)分析及參考PEDV S蛋白表達(dá)策略后［25］，將S基因進(jìn)行截短表達(dá)，分別構(gòu)建了pET28a-S1-NTD（50aa-286aa）、pET28a-S1-CTD（278aa-616aa）以及pET28a-S2（601aa-1087aa）原核表達(dá)載體，在對(duì)比了3種原核表達(dá)蛋白的量、純化難易程度和反應(yīng)原性后發(fā)現(xiàn)S1-CTD蛋白是后續(xù)研究的最佳選擇［16］。經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)與超聲破碎后，目的蛋白主要以包涵體存在。在前期本研究利用切膠純化包涵體蛋白，但一次性制備較多PAGE膠并不能滿足后續(xù)復(fù)性實(shí)驗(yàn)所需蛋白量，因此選擇Ni+親和層析柱純化溶解后的包涵體蛋白。

表3 PDCoV臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Clinical detection of PDCoV samples

目前檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法主要以N蛋白較多，但有研究表明PEDV的M和N蛋白與PDCoV會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)［26-27］，而S蛋白是介導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的主要蛋白，因此以S蛋白為抗原建立抗體方法在免疫評(píng)價(jià)中將具有較好的應(yīng)用前景［28-30］。王經(jīng)緯等［31］用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)S1蛋白作為包被抗原建立的ELISA檢測(cè)方法靈敏度更高，但真核表達(dá)存在成本高、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。而本研究基于PDCoV的S1-CTD采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)，抗原制備更簡(jiǎn)單。本研究表達(dá)的蛋白都以包涵體的形式存在，不同批次復(fù)性后的重組蛋白在穩(wěn)定性和活性上均略有差異［32-33］。因此ELISA試劑盒的組裝和推廣應(yīng)用，仍需要在蛋白表達(dá)、包被和試劑配比等工藝上優(yōu)化。

PDCoV尚無(wú)商品化的抗體ELISA試劑盒，為了評(píng)價(jià)本研究建立的ELISA方法，我們選擇了VNT作為對(duì)照進(jìn)行比較。選取的30份豬血清樣本，ELISA與VNT兩種方法的總符合率達(dá)到83.3%。其符合率不夠高可能是因?yàn)閂NT測(cè)定的是與血清中和后病毒的感染力，從而判定抗體的中和能力，而ELISA只能判定血清的陰陽(yáng)性，數(shù)值不能直接反映抗體水平，當(dāng)血清中抗體效價(jià)太低時(shí)，VNT判定為陰性，但仍然在ELISA的檢測(cè)范圍之內(nèi)，為陽(yáng)性，因此本試驗(yàn)ELISA檢出的陽(yáng)性率比VNT的偏高。血清學(xué)調(diào)查顯示PDCoV在我國(guó)感染非常普遍，逢鳳嬌等［34］用ELISA檢測(cè)我國(guó)2014-2016年不同地區(qū)豬場(chǎng)的100份臨床血清，PDCoV陽(yáng)性率高達(dá)45.9%；Su等［20］檢測(cè)黑龍江的319份樣本，PDCoV抗體陽(yáng)性率達(dá)11.59%；楊浩等［21］以 N蛋白建立的 ELISA 檢測(cè)湖北、河南、河北地區(qū)的部分豬場(chǎng)267 份臨床血清，PDCoV 抗體陽(yáng)性率高達(dá) 66.67%。本研究以S1-CTD蛋白建立的ELISA檢測(cè)2012-2017年收集自四川地區(qū)的490份豬血清，PDCoV總體陽(yáng)性率為49.18%，從血清學(xué)角度證實(shí)PDCoV已在四川地區(qū)流行，但不同地區(qū)感染率有較大差異。結(jié)果顯示在達(dá)州、宜賓、阿壩、巴中部分豬場(chǎng)的血清陽(yáng)性率高達(dá)93.33%-100%，我們追蹤樣品記錄發(fā)現(xiàn)血清樣品集中來(lái)源于部分豬場(chǎng)，且部分豬場(chǎng)存在腹瀉發(fā)病史，因此這些地區(qū)的樣品陽(yáng)性率僅代表采樣豬場(chǎng)的信息，不能代表該地區(qū)的總體感染情況。四川總體的感染情況尚不完全清楚，若全面開(kāi)展PDCoV感染的血清學(xué)調(diào)查，則要從血清樣品收集時(shí)間（季節(jié)）、豬群結(jié)構(gòu)、免疫背景、樣品豬場(chǎng)的發(fā)病信息、樣品區(qū)域覆蓋、采樣的豬場(chǎng)數(shù)量、豬場(chǎng)抽樣比例等綜合設(shè)計(jì)，才能相對(duì)準(zhǔn)確反映該病感染的真實(shí)情況。本次檢測(cè)初步反映PDCoV在四川局部地區(qū)感染普遍，應(yīng)引起我們的高度重視。

4 結(jié)論

本研究表達(dá)和純化S1-CTD蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法，用該方法從血清學(xué)角度證明2012-2017年四川部分地區(qū)的PDCoV總體陽(yáng)性率為49.18%（241/490），該ELISA可用于PDCoV血清學(xué)調(diào)查和抗體評(píng)估。