馬群 馬磊

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬南陽市第一人民醫(yī)院，河南 南陽 473010）

肺癌是目前世界上最為常見的腫瘤之一，全球每年因肺癌死亡人數(shù)超過100萬人[1]。在我國，肺癌發(fā)病率和病死率逐年升高，并居于惡性腫瘤首位。放化療雖能提高患者生存率，但毒副作用嚴重，輕則損傷患者細胞免疫功能，導(dǎo)致放化療失敗，增加并發(fā)癥等，嚴重影響患者生存時間及生活質(zhì)量[2]。研究顯示，患者免疫功能低下或受抑制時，肺癌的發(fā)病率明顯增高[3]；同時體內(nèi)腫瘤進行性生長進一步導(dǎo)致患者的免疫功能受抑制，兩者互為因果。研究證實程序性死亡受體1（Programmed death protein-1，PD-1）及程序性死亡受體配體1（Programmed death ligand-1，PD-L1）可維持和誘導(dǎo)外周組織的免疫耐受，并在病理情況下下調(diào)T細胞免疫刺激性細胞因子分泌，促進免疫抑制性細胞因子分泌，從而抑制T細胞的免疫反應(yīng)[4]。

本文運用免疫組化法檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織中程序性死亡受體PD-1及其配體PDL1的陽性表達，分析二者與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為肺癌的免疫治療提供一定的支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2013年1月至2015年1月住院的非小細胞肺癌手術(shù)患者共85例，收集患者癌組織及癌旁組織（距癌灶＞3 cm以上）石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準：首次接受手術(shù)治療；未接受化療和放療；患者均知情并簽署知情同意書，并經(jīng)院倫理委員會的批準。排除標(biāo)準：合并其他腫瘤疾病的患者；自身免疫性疾病。其中男56例，女29例；年齡42-84歲，平均62.41±6.87歲；鱗癌45例，腺癌30例；組織學(xué)分極，G1期31例，G2期26例，G3期22例；臨床分期：I期19例，II期17例，III期26例，IV期23例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例?；颊呓邮荛T診或電話隨訪3～60 m。

1.2 PD-1和PD-L1在癌組織和癌旁組織的表達

脫蠟4 μm厚的組織切片，以含0.3%過氧化氫的甲醇溶液封閉15 min，經(jīng)PBS沖洗后，以10%牛血清處理20 min。然后采用PD-1和PD-L1一抗（1：150）4℃孵育過夜。PBS沖洗后，將標(biāo)本用過氧化物酶標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白處理30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、鏡檢。以PBS代替一抗作為陰性對照。

由兩位病理科醫(yī)師結(jié)合陽性細胞比例和染色強度做出判斷。陽性細胞比例評分：陽性細胞＜1%為0分，1%-24%為1分，25%-49%為2分，50-74%為3分，75-100%為4分；染色強度記分：無染色細胞為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩者相乘≥3分為陽性?？偡e分0-2分：-，3-4分：+，5-8分：++，9-12分：+++。-/+低表達，++/+++高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±SD）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗進行生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1和PD-L1在肺癌組織中的表達

PD-1主要表達于細胞膜，呈淺黃色到棕褐色，見圖1A；85例癌組織中陽性表達69例（81.18%），癌旁組織陽性表達21例（24.71%）。而PD-L1主要表達于細胞質(zhì)，呈淺黃色到棕褐色，見圖1C，85例癌組織中陽性表達70例（82.35%），癌旁組織陽性表達23例（27.06%）。

圖1 PD-1和PD-L1在肺癌組織中的表達（×200）

2.2 PD-1和PD-L1與肺癌病理、臨床特征的關(guān)系

PD-1和PD-L1蛋白表達與肺癌的組織分類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），見表1。

2.3 PD-1與PD-L1在肺癌中的相關(guān)性分析

在非小細胞肺癌組織中，PD-1與PD-L1蛋白表達成正相關(guān)，見表2。

表1 PD-1和PD-L1與肺癌病理、臨床特征的關(guān)系

表2 PD-1與PD-L1在非小細胞肺癌中的相關(guān)性分析（例）

2.4 PD-1和PD-L1與肺癌患者生存的相關(guān)分析

在非小細胞肺癌中組織中，PD-1和PD-L1蛋白高表達患者總生存明顯低于低表達患者（P＜0.05），見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

2.5 多因素Cox回歸分析

Cox逐步多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期、PD-1和PD-L1均是非小細胞肺癌患者預(yù)后的獨立影響指標(biāo)。

3 討論

腫瘤免疫逃逸是腫瘤生存的重要策略。腫瘤免疫逃逸的機制很多，包括免疫抑制，這已成為近年來的研究熱點。PD-L1/PD-1信號通路是腫瘤免疫抑制的重要組成部分，可以抑制T淋巴細胞的活化并增強腫瘤細胞的免疫耐受性，從而實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[5]。

PD-1屬于CD28家族成員，由268個氨基酸構(gòu)成，在多種免疫細胞表面均有表達。PD-1結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，其胞內(nèi)區(qū)尾部的C端和N端含有兩個獨立的位點[6]。PD-L1和PDL2是目前已被證實的PD-1的兩個配體，研究發(fā)現(xiàn)活化后的T細胞能釋放細胞因子使PD-L1上調(diào)，而上調(diào)后的PD-L1會與PD-1結(jié)合抑制T細胞導(dǎo)致其凋亡，減輕T細胞對周圍組織損傷[7]。另一方面，磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal transduction and activators of transcripttion 3，STAT）等信號通路可誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生PD-L1，與受體結(jié)合抑制T細胞活性，使得腫瘤細胞實現(xiàn)免疫逃逸[8]。

表2 多因素Cox回歸分析

本研究發(fā)現(xiàn)，PD-1、PD-L1蛋白在非小細胞肺癌中的陽性表達率明顯高于癌旁肺組織，且與肺癌的組織分類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期相關(guān)。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺癌組織PD-1、PD-L1蛋白水平相對增加，并伴隨組織學(xué)分級、臨床分期增加而增加，提示PD-1、PD-L1與非小細胞肺癌的發(fā)生、進展關(guān)系密切，是輔助診斷非小細胞肺癌的的有效的腫瘤標(biāo)記物。隨訪結(jié)果提示，PD-1、PD-L1蛋白高表達患者與低表達患者相比總生存較差，說明PD-1、PD-L1蛋白是較好的診斷非小細胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)，這與其他組織腫瘤的預(yù)后比較類似。PD-L1和PD-1的表達均與非小細胞肺癌患者腫瘤細胞侵襲性腫瘤生物學(xué)特征相關(guān)，基質(zhì)PD-1表達與基質(zhì)PD-L1染色以及腫瘤內(nèi)和基質(zhì)CD8表達均顯著相關(guān)[9]，基質(zhì)PD-1 / PD-L1的表達可能是非小細胞肺癌患者的預(yù)后指標(biāo)?？梢?，PD-1、PD-L1是潛在的治療非小細胞肺癌的靶點。

同時本研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織PD-1蛋白水平與PD-L1蛋白表達水平呈正相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期、PD1和PDL1均是非小細胞肺癌患者預(yù)后的獨立影響指標(biāo)，其原因可能是PD-L1基因可通過與腫瘤細胞PD1結(jié)合，降低機體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進展[10]。

綜上所述，PD-1、PD-L1有望成為非小細胞肺癌治療中一種新的預(yù)后工具和生物標(biāo)記物。