宋夢強 陳燕 楊正蓉 李成良 盧鎮(zhèn)江 陳熙 肖賢培 鄭倩

（1. 川北醫(yī)學院2017級臨床專業(yè)，四川 南充 637100；2. 川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院機能中心，四川 南充 637100）

缺氧是指因組織的氧氣供應不足或用氧障礙，而導致組織的代謝、功能和形態(tài)結構發(fā)生異常的病理過程，長時間的供氧不足及用氧障礙會給機體帶來嚴重危害，而大腦、心臟等生命重要器官缺氧也是導致機體死亡的重要原因[1]。疲勞是指機體在一定條件下，長時間繁重、緊張的腦力和體力勞動引起的工作效率暫時性降低的一種生理病理狀態(tài)，疲勞可以導致缺氧產(chǎn)生。

疲勞狀態(tài)不及時改善，可能會導致機體內(nèi)分泌失調、免疫力下降、引起疾病的發(fā)生[2]。隨著環(huán)境污染的進一步惡化以及生活節(jié)奏加快，使處于缺氧和疲勞狀態(tài)的人群比例日益增加[3]。目前缺氧和疲勞產(chǎn)生的機制認為與自由基生成過多有關，體內(nèi)自由基生成、脂質過氧化加速，造成自由基堆積，產(chǎn)生更多的氧化活性產(chǎn)物，造成機體的損害[4]。因此增加抗氧化能力，可以提高機體的缺氧耐受能力和抗疲勞作用，篩選提高機體的缺氧耐受能力和抗疲勞藥物具有十分重要的現(xiàn)實意義。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是茶葉中含量最為豐富的一種兒茶素,約占總兒茶素50%～60%[5,6]。

目前研究認為EGCG作用廣泛，具有抗腫瘤[7-9]，抗菌消炎[10]，降血脂，降血糖，預防心腦血管疾病以及神經(jīng)元保護作用[11-14],多項報道認為EGCG可顯著增加機體的抗氧化能力，抑制體內(nèi)過氧化物生成，具有較強自由基清除能力[15-17]。但是EGCG對缺氧耐受和抗疲勞的研究較少，本實驗通過兩種不同濃度EGCG灌胃小鼠，觀察其對低張性缺氧和亞硝酸鈉中毒缺氧以及急性缺血缺氧三種模型的小鼠存活時間的影響，通過小鼠游泳和爬桿實驗結果來評估EGCG抗疲勞作用，并通過測定小鼠肝臟中超氧化歧化酶（Superoxiadeismutase，SOD）的活性和丙二醛（Maleicdicdialdehyde，MDA）的含量來初步探究EGCG對缺氧耐受和抗疲勞的機制，為EGCG開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年雄性健康昆明小鼠75只，體重24-28 g，小鼠由川北醫(yī)學院動物實驗中心提供（許可證號為SCXK(川）2018-18）。小鼠飼養(yǎng)溫度為26 ℃，普通飼料由川北醫(yī)學院動物實驗中心提供。

小鼠隨機分為3組：對照組（NOR)、低劑量組EGCG1（10 g·（kg·d）-1）、高劑量組EGCG2（50 g·（kg·d）-1），EGCG組每天中午14時連續(xù)給小鼠灌胃 25 d；對照組灌胃生理鹽水，每天中午14時灌胃0.1 g·kg-1生理鹽水，持續(xù)25 d。每組中再隨機分為五組：低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒性缺氧實驗、急性缺血缺氧實驗和小鼠負重游泳實驗和爬桿實驗，其中進行爬桿實驗的小鼠需要進行爬桿訓練，每天1次，每次5 min。

1.2 實驗儀器及試劑

實驗儀器：缺氧瓶、灌胃針、離心管、微孔板、組織研磨器、離心機、恒溫水浴箱等。

試劑：EGCG（北京索萊寶科技有限公司，Cat#SE8120）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所，A001-1 ），丙二醇（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所，A003-1），BSA標準品、BCA工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 低張性缺氧實驗

EGCG灌胃25 d，各組小鼠最后一次灌胃30 min后，每組隨機選出5只小鼠放入缺氧瓶中，瓶中盛有5 g鈉石灰，每個缺氧瓶放1只小鼠，為確保缺氧瓶的密閉性，小鼠放入后用凡士林涂抹瓶口周圍，并立即計時，準確記錄小鼠死亡時間。判斷標準為小鼠胸口不再起伏，死亡時間為判定小鼠對低張性缺氧耐受時間。

1.3.2 亞硝酸鈉中毒性缺氧實驗

EGCG灌胃25 d，各組小鼠最后一次灌胃30 min后，每組隨機選出5只小鼠，小鼠采用腹腔注射5%亞硝酸鈉溶液（0.1 L·kg-1）,給藥后立即記錄小鼠死亡時間，判斷標準和低張性缺氧實驗一致。

1.3.3 急性缺血缺氧實驗

EGCG灌胃25 d，各組小鼠最后一次灌胃 30 min后，每組隨機選出5只小鼠，用剪刀自小鼠頸部快速斷頭，觀察斷頭后小鼠張口喘息，秒表記錄其出現(xiàn)張口喘息至停止呼吸的時間，時間為判定小鼠急性缺血缺氧實驗耐受時間。

1.3.4 小鼠負重游泳實驗

EGCG灌胃25 d，各組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機選出5只小鼠，將小鼠放入水槽水溫穩(wěn)定于25±2℃環(huán)境中進行游泳實驗，小鼠1/3—2/3處綁縛自身體重8%鉛絲，且系鉛絲的繩子不能接觸水槽底，在整個實驗過程每只小鼠四肢需要不停運動，用秒表準確記錄小鼠負重游泳時間，判斷標準為小鼠入水至頭部全部入水持續(xù) 8S內(nèi)不能浮出水面為止的時間。

1.3.5 小鼠爬桿實驗

EGCG灌胃25 d，各組小鼠最后一次灌胃 30 min后，每組隨機挑選5只，小鼠分別放在長110 cm、 直徑7 mm的垂直懸掛的光滑玻璃棒上端，記錄小鼠從爬桿開始，直至肌肉疲勞而無力抱住玻璃棒滑落地上的時間。

1.3.6 肝臟SOD活性和MDA含量測定

小鼠低張性缺氧死亡后迅速解剖取出肝臟，放入盛有9倍體積的0.9%氯化鈉溶液，將剪碎的肝臟組織充分研磨，制備好的勻漿離心10 min（3000 rpm·min-1），上清液分裝待用。根據(jù)SOD、MDA試劑盒說明書操作，通過計算即可求出被測樣品中MDA含量及SOD活力。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)相關資料采用SPSS18.0軟件來進行分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（±SD）表示，組間采用方差和t檢驗，P＜0.05表示結果有顯著差異。

2 結果

2.1 不同濃度EGCG對小鼠缺氧模型的影響

對小鼠低張性缺氧的影響，給予小鼠灌胃EGCG 25天后，檢測各組之間小數(shù)低張性缺氧差異，與干預前相比，EGCG組的小鼠低張性缺氧死亡時間均明顯延長，其中高劑量組作用更為明顯（P＜0.05）。對小鼠亞硝酸鈉中毒性缺氧實驗發(fā)現(xiàn)EGCG組明顯延長存活時間，高劑量組延長更為顯著（均P＜0.05），顯示不同濃度EGCG灌胃后明顯延長小鼠亞硝酸中毒缺氧耐受的時間。與對照組相比，高、低劑量EGCG組小鼠斷頭后張口呼吸時間明顯延長（P＜0.05），結果表明，EGCG在一定程度上能提高小鼠急性缺血缺氧的存活時間。結果參見表1和圖1。

表1 EGCG對小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉和急性缺血缺氧的影響（±SD）

表1 EGCG對小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉和急性缺血缺氧的影響（±SD）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別 n 低張性缺氧存活時間（min） 亞硝酸鈉中毒性缺氧存活時間（min） 急性缺血缺氧實驗（min) NOR 5 6.34±0.21 20.73±1.64 19.30±0.62 EGCG1 5 8.97±0.43* 26.76± 1.48 * 22.56+2.63* EGCG2 5 9.39±0.61* 29.41± 2.06* 25.49+3.25*

圖1 不同濃度EGCG對小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒性缺氧和急性缺血缺氧的影響

2.2 不同濃度EGCG對小鼠負重游泳的影響

低濃度負重游泳時間從對照組96.4±13.50s提高到303.56±20.01s，與干預前相比，高濃度負重游泳時間從96.4±13.50s增加到451.75±124.1s，結果表明高、低濃度EGCG兩組小鼠負重游泳時間明顯提高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 EGCG對小鼠爬桿實驗和負重游泳實驗的影響（±SD）

表2 EGCG對小鼠爬桿實驗和負重游泳實驗的影響（±SD）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別 n 爬桿時間（s） 游泳時間（s） NOR 5 74±8.48 96.4±13.50 EGCG1 5 83.5±16.42＃ 303.56±20.01*EGCG2 5 415.25±124.13* 451.75±63.25 *

2.3 不同濃度EGCG對小鼠爬桿實驗的影響

給予小鼠灌胃EGCG 25d后進行爬桿實驗，與對照組比較，EGCG1低劑量組延長爬桿時間，但是差異無統(tǒng)計學意義。EGCG2高劑量組爬桿時間明顯延長，提示小鼠抗疲勞能力明顯上升，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.4 各組小鼠肝組織勻漿中MDA含量和SOD活性

如表3所示，與NOR組相比，高、低劑量EGCG組小鼠肝臟勻漿MDA含量明顯減少（P＜0.05），說明EGCG可以降低肝臟中MDA的含量，且EGCG可顯著提高SOD的活性，與對照組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表3 EGCG對小鼠肝臟SOD活性、MDA含量的影響（±SD）

表3 EGCG對小鼠肝臟SOD活性、MDA含量的影響（±SD）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別 n SOD活性(μ·g-1) MDA(nmol·g-1) NOR 5 156.21±10.06 5.92±1.26 EGCG1 5 184.91±28.19* 4.25±0.08* EGCG2 5 197.04±26.63* 4.18±0.07*

3 討論

低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒缺氧實驗、急性腦缺氧實驗是常用的缺氧模型。小鼠的存活時間是判定小鼠抗缺氧和抗疲勞的重要指標，三項實驗任意兩項實驗結果陽性，可判定該受試樣品有助于提高缺氧耐受力[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)EGCG可提高小鼠在低張性缺氧瓶中存活時間，可見EGCG具有顯著的抗低張性缺氧的作用。亞硝酸鈉具有氧化作用，使機體的血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，從而血紅蛋白喪失攜帶氧氣的能力，導致機體缺氧[19]。本試驗EGCGG灌胃后腹腔注射亞硝酸鈉，結果顯示EGCG可以明顯提高小鼠在亞硝酸鈉條件下的存活時間，說明其能減弱亞硝酸鹽的氧化作用，提高血紅蛋白攜帶氧氣的能力，從而改善缺氧狀況。實驗同時觀察到EGCG亦可以提高小鼠急性斷頭下的喘息時間，增加存活時間，具有統(tǒng)計學意義，提示EGCG對急性缺氧有保護作用。低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒缺氧實驗、急性腦缺氧實驗均說明EGCG能提高小鼠缺氧耐受力，可能與改善大腦和心臟缺氧狀態(tài)有關。

負重游泳和爬桿實驗是反映耐疲勞的常用方法。實驗結果顯示，EGCG可以顯著延長小鼠負重游泳時間和爬桿時間（P＜0.05），說明EGCG可以提高小鼠抗疲勞能力，緩解運動疲勞。SOD是機體清除氧自由基的重要酶，是反映機體抗氧化水平的重要指標[20]。MDA是自由基引起的脂質過氧化的主要產(chǎn)物，其含量可以間接反映機體抗氧化能力及清除氧化產(chǎn)物的能力[21]，因此SOD和MDA可以作為反應抗氧化能力的指標。本實驗通過測定小鼠肝臟SOD的活性和MDA的含量來探究EGCG對缺氧耐受和抗疲勞機制與抗氧化能力的關系。

結果顯示高、低劑量EGCG組與對照組相比，SOD的活性有明顯的增加趨勢，而MDA的含量降低。證明EGCG可通過上調抗氧化酶SOD的活性，減少體內(nèi)MDA的生成，減少氧化損傷，從而產(chǎn)生缺氧耐受和抗疲勞作用。

本實驗證實EGCG為在耐缺氧及抗疲勞方面的開發(fā)和應用提供了實驗依據(jù)，說明其具有開發(fā)為抗缺氧和抗疲勞產(chǎn)品的潛力，但是機制需要進一步研究。