馮濤 李晶 潘金強(qiáng) 鄭殿宇 魯靜 耿中利 馬震

深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis DVT)是血管外科的常見周圍血管疾病之一[1]。近年來，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢,20%～50%的深靜脈血栓病人又在此基礎(chǔ)上，發(fā)展成血栓后綜合征(post-thrombotic syndrome，PTS)[2-4]。新疆地區(qū)的下肢深靜脈血栓患病率在31.0%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他國家和地區(qū)[5]。根據(jù)當(dāng)?shù)氐纳盍?xí)慣、飲食習(xí)慣、遺傳因素等進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，吸煙、年齡、新鮮蔬菜攝入量是當(dāng)?shù)厝巳哼z傳性易栓癥的主要影響因素。本次通過研究miR-5189-3p在大鼠體內(nèi)過表達(dá)的干預(yù)實驗，驗證靶基因JAG1所在信號通路Notch中Notch1、Hes1、JAG1的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗證miR-5189-3p在下肢深靜脈血栓形成中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：SPF級SD大鼠48只，體重180～200 g，于無特殊病原體(specific pathogen free,SPF)條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度 22～26 ℃，相對濕度 50%～60%，人工光照明暗各12 h。動物來源于三峽大學(xué)實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104，動物合格證號：42010200002507。

2.實驗試劑：HE染色試劑盒(Solarbio公司，中國)，SYBR Green PCR 試劑盒(Biosystems公司，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，日本)，Trizol(Ambion公司，美國)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(bioswamp公司，中國)，BAX Polyclonal Antibody(Bioswamp公司，中國)，Bcl-2 Polyclonal Antibody(Bioswamp公司，中國)。

二、方法

1.動物建模：本次建模以白云城等[6]建立的大鼠下腔靜脈狹窄法建立大鼠下腔靜脈血栓(DVT)模型。將48只SD大鼠隨機(jī)分組，分為4組，分別為正常對照組(A組)、下腔靜脈血栓模型組(B組)、hsa-miR-5189-3p 模擬物組(C組)和hsa-miR-5189-3p模擬物陰性對照組(D組)，每組12只。hsa-miR-5189-3p 模擬物組SD大鼠尾靜脈注射hsa-miR-5189-3p mimics、hsa-miR-5189-3p模擬物陰性對照組SD大鼠尾靜脈注射hsa-miR-5189-3p mimics NC，按5 μg/kg劑量，溶于1 ml生理鹽水中，正常組和下腔靜脈血栓模型組SD大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，注射后24 h造模。大鼠用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除腹部毛發(fā)。大鼠仰臥位，用 75%的酒精消毒腹部皮膚，在腹部正中切開 3～4 cm大小縱行切口，逐層分離肌肉，打開腹腔。打開腹腔后，把腸道推向術(shù)野左側(cè)，打開后腹膜，暴露下腔靜脈，5-0絲線結(jié)扎下腔靜脈分支至髂靜脈，小心分離伴行之腹主動脈，于左腎靜脈下2 mm處穿過一根5-0絲線備用，沿靜脈走向放置一根3-0絲線，然后結(jié)扎下腔靜脈后小心抽出3-0絲線，造成下腔靜脈狹窄模型，逐層縫合腹腔肌肉組織及皮膚，大鼠完全蘇醒后放回飼養(yǎng)籠繼續(xù)飼養(yǎng)。造模后24 h，分批處死動物。

2.靜脈血栓組織病理學(xué)檢查：靜脈血栓組織用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

3.RT-qPCR：通過DNAMAN軟件設(shè)計JAG1、Notch1、Hes1、GAPDH熒光實時定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分別加入2 μl 5×PrimeScript Buffer，0.5 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μl Oligo(dT)15(15 μM)，0.5 μl Random 6 mers(100 μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達(dá)到10 μl，混勻后短暫離心，在PCR儀上37 ℃溫浴15 min，85 ℃加熱5 s，稀釋至35 μl，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA。qPCR反應(yīng)：Forward primer 10 μM 0.8 μl，0.8 μl Reverse primer 10 μM，2XSYBR Select Master Mix(2×)10 μl，RNase-free water 6.4 μl，cDNA template 2 μl，配制成20 μl體系混合均勻，在儀器上保持95 ℃，1 min，95 ℃，10 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，94 ℃ 1 min 30 s，60 ℃ 1 min，60 ℃→94 ℃，1.1 ℃/s升溫，從而獲得qPCR反應(yīng)結(jié)果。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.靜脈血栓組織病理變化：將收集在10%中性福爾馬林的正常對照、下腔深靜脈血栓模型組、hsa-miR-5189-3p模擬物組和hsa-miR-5189-3p模擬物陰性對照組組織進(jìn)行HE染色，觀察組織變化。

靜脈血栓組織HE實驗結(jié)果，見圖1(A～D)。A組大鼠下腔靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的尺寸和形狀保持統(tǒng)一、內(nèi)皮細(xì)胞緊湊而齊整、表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞層無病理變化，未觀察到染色組織內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞和血栓物質(zhì)的存在，同時未觀察到血液內(nèi)的血細(xì)胞和相關(guān)因子存在。B組，術(shù)后24 h，血栓充滿靜脈管腔，血栓內(nèi)存在大量的紅細(xì)及少量白細(xì)胞，血栓機(jī)化不明顯，下腔靜脈管壁未見明顯的粘連，血管內(nèi)皮細(xì)胞無脫落現(xiàn)象，靜脈周圍看見炎細(xì)胞浸潤，瓣膜周圍可見少量炎性細(xì)胞浸潤。C組，靜脈血栓機(jī)化，主要從血栓周邊處開始。有核細(xì)胞開始大量出現(xiàn)在血栓周邊處，致使內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增多、單核細(xì)胞數(shù)量增多、中性粒細(xì)胞數(shù)量增多、巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，與下肢深靜脈血栓組對比，進(jìn)行血栓組織中的有核細(xì)胞較多，機(jī)化程度增加，血栓外周區(qū)域有大量的裂隙產(chǎn)生和形成，從而形成管腔樣結(jié)構(gòu)，有血流再通的征象，可見少許紅細(xì)胞的存在。D組，靜脈血栓機(jī)化，主要從血栓周邊處開始。有核細(xì)胞開始出現(xiàn)在血栓周邊處，致使單核細(xì)胞數(shù)量增多、中性粒細(xì)胞數(shù)量增多、巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，與下肢深靜脈血栓組對比，進(jìn)行血栓組織中的有核細(xì)胞較多，機(jī)化程度增加，血栓外周區(qū)域有部分小裂隙產(chǎn)生和形成，從而形成管腔樣結(jié)構(gòu)，有血流再通的征象，可見少許紅細(xì)胞的存在。

A：A組，下腔靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的尺寸和形狀保持統(tǒng)一、緊湊而齊整、表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞層無病理變化；B:B組，血栓充滿靜脈管腔；C：C組，靜脈血栓機(jī)化，血栓外周區(qū)域有大量的裂隙產(chǎn)生和形成，從而形成管腔樣結(jié)構(gòu)，有血流再通的征象；D：D組，靜脈血栓機(jī)化，血栓外周區(qū)域有部分小裂隙產(chǎn)生和形成，從而形成管腔樣結(jié)構(gòu)，有血流再通的征象

2.qRT-PCR技術(shù)檢測SD大鼠下腔靜脈組織中基因表達(dá)情況：通過miRNA預(yù)測靶基因，檢測組織樣品中JAG1、Hes1、Notch1 四個指標(biāo)在不同分組組織中的表達(dá)差異性，具體結(jié)果見表1、圖2(A～C)。對A組，B組，C組和D組，分別進(jìn)行JAG1、Hes1、Nothch1 四個基因表達(dá)分析。實驗結(jié)果顯示，JAG1在 C組與B組、C組與D組之間表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Hes1在A組和其他各組、C組與B組、C組與D組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Notch1在C組與B組、C組與D組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 JAG1、Notch1、Hes1在A組、B組、C組和D組之間的基因表達(dá)差異性

圖2 JAG1、Hes 1、Notch1在不同分組之間的基因表達(dá)差異性

討論

近年來，在心血管疾病方面，miRNA對血管生成的作用成為研究重點，已知的miRNA包括miR-126、miR-21、miR-221、miR-222等[7-10]。深靜脈血栓的引起因素之一為血管損傷，血管損傷早期表征為血管內(nèi)皮功能降低或發(fā)生障礙。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在血管損傷后和修復(fù)過程中，主要對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化起到作用。例如miR-126可以起到抑制血管內(nèi)膜細(xì)胞病變，促進(jìn)血管損傷的修復(fù)，保證血管內(nèi)皮的整體完整性，防止血管損傷加重，通過miR-126抑制劑檢測，EPCs的遷移增殖能力下降。miR-221可以和靶向基因PAK 1相互作用，從而影響MEK/ERK信號通路，抑制EPCs的增殖[11-12]。

JAG1，又被叫做Jagged1，是Notch受體的四大配體之一，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在新生血管的形成發(fā)展中起到很重要的作用[13]。有研究表明，JAG1基因敲除后，動物的胚胎血管重塑以及卵黃囊的血管重塑都會出現(xiàn)不同程度的障礙問題，會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞無法形成功能性作用的網(wǎng)狀環(huán)樣結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞的遷移能力和細(xì)胞間的傳遞功能大幅度下降、新生血管無法正常發(fā)育、胚胎較容易出現(xiàn)死胎癥狀。因此，hsa-miR-5189-3p的靶基因JAG1在下肢深靜脈血栓中也應(yīng)該起到對靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)、新生血管的形成、細(xì)胞間的功能性因子傳遞等作用，避免下肢深靜脈血栓的形成。

本次實驗通過對hsa-miR-5189-3p的目標(biāo)基因JAG1的研究發(fā)現(xiàn)，JAG1是信號通路Notch里面的一個重要調(diào)控因子。Notch信號通路是一條高度保守的信號傳導(dǎo)途徑，可以控制相關(guān)傳導(dǎo)因子的表達(dá)高低來起到調(diào)控的功能。其中Notch 1受體分布較廣，其普遍的表達(dá)于多種組織，包括心臟組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。Notch的四個配體Dll 1, Dll 4, Jaggde l和Jagged 2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中都有表達(dá)，并在血管發(fā)育中起重要的作用。相關(guān)研究結(jié)果顯示Notch 1的缺失會造成實驗動物的無法形成完整功能的血管，而無法生存。Krebs等[14]實驗結(jié)果闡明，Notch1受體和Notch4受體之間的相互作用在血管形成過程中起到極大的影響作用。Takeshita等[15]通過建立缺血動物模型實驗發(fā)現(xiàn)，缺血組織的Notch信號通路基因和蛋白表達(dá)量較對照組明顯升高，內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度明顯增加，又通過實驗發(fā)現(xiàn)病理組織區(qū)域內(nèi)，有大量的新生血管在形成，對病灶區(qū)進(jìn)行修復(fù)。說明了該通路信號因子對血管的發(fā)生、發(fā)展和形成過程起到積極的調(diào)控作用。

綜上所述，JAG 1、Hes 1、Notch 1基因表達(dá)與miR-5190-3p的基因表達(dá)呈正相關(guān)。Hes 1是Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶基因，轉(zhuǎn)錄的Hes 1 mRNA又可以進(jìn)一步調(diào)控下游分子的蛋白表達(dá)。因此，miR-5190-3p基因的過表達(dá)，可以作用于JAG 1及Notch 1和Hes 1的基因表達(dá)，使得JAG 1、Hes 1、Notch 1基因表達(dá)得到增強(qiáng)，Notch信號通路的激活，促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，抑制凋亡，進(jìn)而抑制深靜脈血栓形成。