崔寶祿，陳國(guó)平

（1. 黔南民族師范學(xué)院，貴州 都勻 558000；2. 重慶大學(xué)，重慶 沙坪壩 400044）

0 引言

【研究意義】Trihelix轉(zhuǎn)錄因子屬植物特有，其SIP1亞家族基因調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究還不成熟。番茄作為雙子葉模式植物和重要的蔬菜作物，其SIP1亞家族基因的研究更是被邊緣化。因此，研究SIP1亞家族基因的功能與調(diào)控模式，對(duì)提高該家族基因的認(rèn)識(shí)、增強(qiáng)作物改良的力度具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒特定區(qū)域含有生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素的編碼基因，其中tml位點(diǎn)（6b基因）參與了植物器官腫瘤的形成。部分植物Trihelix轉(zhuǎn)錄因子可與6b編碼的蛋白質(zhì)互作，被稱為Nicotiana tabacum 6b-interacting protein 1（NtSIP1），其編碼基因主要在根、莖、成熟葉和植物頂端區(qū)均有表達(dá)；NtSIP1包含2個(gè)保守域，核定位信號(hào)區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)；NtSIP1可促進(jìn)6b蛋白與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的增殖；NtSIP1 對(duì)6b蛋白進(jìn)入細(xì)胞核有促進(jìn)作用，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證實(shí)，NtSIP1與植物細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂等功能有關(guān)[1]。擬南芥中，與6b互作的蛋白Arabidopsis 6binteracting protein 1-like 1（ASIL1）屬于Trihelix轉(zhuǎn)錄因子，突變體asil1子葉性狀發(fā)生改變：幼苗積累白蛋白、脂肪酸等代謝物質(zhì)，重要的是ASIL1可識(shí)別GT-box[2]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明：ASIL1的N末端和中心結(jié)構(gòu)域變化較大，氨基酸序列中含有核定位信號(hào)和甘氨酸/脯氨酸富集區(qū)[2]。以上分析表明，Trihelix轉(zhuǎn)錄因家SIP1亞家族蛋白可與6b蛋白互作，其功能研究多見于植物種子。許多植物的基因組中均發(fā)現(xiàn)了SIP1亞家族的基因信息。禾本科植物谷子（Setaria italia）中含有10個(gè)基因[3]；苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）中有9個(gè)假定的SIP1基因[4]；而十字花科大白菜（Brassica Rapa）中，發(fā)現(xiàn)19個(gè)假定的SIP1基因[5]。除此之外，yu等[6]研究證實(shí)，茄科植物番茄基因組中含有12個(gè)假定的SIP1亞家族基因，11個(gè)基因含有0～1個(gè)內(nèi)含子，Solyc09g008850含有6個(gè)內(nèi)含子，編碼256～532個(gè)氨基酸；在非生物脅迫和激素誘導(dǎo)下，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，初步分析了Solyc12g010890和Solyc07g055100基因響應(yīng)外源因素的情況。【本研究切入點(diǎn)】雖然多種植物的SIP1亞家族基因被發(fā)現(xiàn)，但其生物功能的研究還不盡人意，有待進(jìn)一步深入。番茄作為重要的模式植物，具有基因組小、基因組測(cè)序完整、遺傳轉(zhuǎn)化效率高且穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，但番茄中SIP1亞家族基因的功能尚不明晰?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以番茄自交品種AC++為研究對(duì)象，利用RNAi干擾技術(shù)抑制了番茄體內(nèi)SLSIP1L12基因的表達(dá)，鑒定了番茄中SLSIP1L12基因的生物功能，為豐富Trihelix轉(zhuǎn)錄家族SIP1亞家族基因的遺傳信息提供了參考，更為茄科植物的新品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用番茄野生品種AC++（Solanum lycopersicom Mill. cv. Ailsa Craig，引自重慶大學(xué)，屬于高度自交品種，遺傳性狀穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)），種植在黔南民族師范學(xué)院溫室大棚中，光照16 h（27 ℃）和黑暗8 h（19 ℃）。待植株開花結(jié)果后，分別選取成熟植株的根、莖、葉、花，果實(shí)分為未成熟果實(shí)（Immature green，IMG）、成熟果實(shí)（Mature green，MG）、破色果實(shí)（Breaker, B）、破色后4 d（B+4）、破色后7 d（B+7），見圖1所示。所有材料液氮速凍后，存放于?80 ℃冰箱。

1.2 番茄SlSIP1蛋白的生物信息學(xué)分析

將擬南芥、番茄等已知物種報(bào)道的基因序列在茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SGN中搜索番茄所有SlSIP1蛋白的氨基酸序列。將檢索的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)的結(jié)果確定該基因編碼的氨基酸序列可能的保守結(jié)構(gòu)域。利用氨基酸序列進(jìn)行生物進(jìn)化分析，預(yù)測(cè)該基因的生物功能。cDNA和基因組的比對(duì)采用網(wǎng)站（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）完成；保守區(qū)預(yù)測(cè)采用網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）完成；多重序列比對(duì)采用軟件ClustalX 和DNAMAN，進(jìn)化樹分析采用軟件MEGA10。

1.3 基因克隆

利用RNAiso Plus提取試劑提取番茄材料RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得組織材料的cDNA作為基因克隆模板。搜索NCBI和SGN數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)引物cSlSIP1L12-F和cSlSIP1L12-R，擴(kuò)增出編碼序列，連接到pMD19-T載體上測(cè)序。

1.4 植物激素和非生物脅迫處理

番茄AC++種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，生長(zhǎng)35 d后用于外源激素的處理和非生物脅迫[7]。

生長(zhǎng)35 d的番茄幼苗，分別接受噴水（一次性噴水，直到所有葉片滴水為止）、脫水（在水中清洗幼苗根系，直至土壤清洗干凈。放于室溫后，開始取樣，取處理的幼苗中部葉片）、機(jī)械損傷（取幼苗中部葉片，用剪刀剪碎葉片至長(zhǎng)寬約為1 cm）處理0、1、2、4、8、12、24、36 h后，將處理材料放入液氮速凍后，存放于?80 ℃冰箱[8]。

生長(zhǎng)35 d的番茄幼苗，分別采用噴水（對(duì)照，CK）、50 μmol·L?1IAA、50 μmol·L?1GA3、50 μmol·L?1茉莉酸 甲 酯（MeJA）、100 μmol·L?1ABA、100 μmol·L?1ACC噴淋1次，直到所有葉片開始滴水為止，分別于0、1、2、4、8、12、24 h后，取幼苗中部葉片放入液氮速凍后，存放于?80 ℃冰箱[9]。

1.5 RT-PCR分析

所有材料采用Trizol試劑提取總RNA，定量PCR采 用SYBR Premix Ex Taq II kit（Promega）體系：5.0 μL 2×SYBR Premix酶、0.5 μL引物、1.0 μL cDNA、3.5 μL去離子水。表達(dá)模式分析和轉(zhuǎn)基因沉默效率鑒定采用基因SlCAC為內(nèi)參，處理采用基因SlEF1a為內(nèi)參[10]，具體引物見表1。

表 1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers applied

1.6 SlSIP1L12基因沉默株系的建立

以cDNA為模板，以SlSIP1L12-F和SlSIP1L12-R為引物，以Primer Star mix酶高保真擴(kuò)增后，連接到pMD19-T載體上測(cè)序，序列比對(duì)分析后得到片段大小為455 bp的基因特異序列。采用雙酶切方式以正、反向的方式連接到中間載體pHANNIBAL，再連接到終載體pBI19上。然后，通過(guò)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌LBA4404中，侵染番茄子葉，誘導(dǎo)愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因幼苗，誘導(dǎo)生根，利用卡那霉素編碼基因NPTII設(shè)計(jì)引物，鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。以 qSlSIP1L12為引物，利用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系的沉默效率。

1.7 種子發(fā)芽試驗(yàn)

50粒均勻的轉(zhuǎn)基因和AC++種子播種在含有2層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中（蒸餾水或加入了消毒劑硫柳汞），黑暗條件下，放入（15±1） ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胚根突出種皮2 mm作為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)種子 的發(fā)芽率，試驗(yàn)重復(fù)3～5次[11]。

1.8 種子體內(nèi)ABA總含量檢測(cè)

ABA含量的測(cè)定采用ABA的ELISA試劑盒（上海生工）[12]，試驗(yàn)方法是：0.1 g發(fā)芽種子（轉(zhuǎn)基因和AC++種子在發(fā)芽7 d后），用濾紙吸水后，用液氮研磨，80%的甲醇抽提，1 000 r·min?1離心20 min，取上清液，用孔徑為0.45 μm的濾膜清除雜質(zhì)后，按照ELISA說(shuō)明書進(jìn)行操作，在波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)結(jié)果，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線鑒定ABA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlSIP1L12基因生物信息分析

以番茄AC++的cDNA為模板，擴(kuò)增SlSIP1L12基因（基因ID：Solyc12g043090）的編碼序列。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，總長(zhǎng)為1 125個(gè)堿基，編碼374個(gè)氨基酸，比報(bào)道的番茄品種1 706少3個(gè)堿基/1個(gè)氨基酸[6]，缺少的氨基酸是N末端第61位的谷氨酸，這可能與所用番茄的品種有關(guān)。進(jìn)一步分析表明，該氨基酸序列的保守區(qū)位為135～222和302～358區(qū)段，保守區(qū)可形成Trihelix結(jié)構(gòu)域、第四螺旋和一個(gè)保守中央結(jié)構(gòu)域（圖2）；核定位單元信號(hào)為193～203和212～221區(qū)段。圖3進(jìn)化分析表明，番茄SlSIP1L12與SlSIP1L5位于同一分枝，但SlSIP1L12與所有檢測(cè)蛋白序列的一致性均低于47.2%（表2），說(shuō)明，番茄內(nèi)部SIP1亞家族進(jìn)化較明顯。

2.2 SlSIP1L12基因表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步預(yù)測(cè)基因的生物學(xué)功能，利用RTPCR檢測(cè)了SlSIP1L12基因在番茄品種AC++不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，基因SlSIP1L12在莖、成熟葉中表達(dá)量最高，在花、果實(shí)等生殖器官和組織中次之，在根、幼葉中表達(dá)量最低（圖4）。

圖 2 SIP1亞家族蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 2 The structure of SIP1 proteins

圖 3 生物進(jìn)化分析SIP1亞家族蛋白質(zhì)Fig. 3 Phylogenetic analysis of SIP1 proteins

表 2 氨基酸序列一致性分析Table 2 The similarity of SIP1 proteins

2.3 SlSIP1L12對(duì)外源植物激素和非生物脅迫的響應(yīng)

圖5-A表明，IAA、GA3、MeJA和ACC（乙烯合成的前體）等4種激素處理24 h后，SlSIP1L12基因表達(dá)水平并未發(fā)生顯著變化，而接受ABA處理時(shí)，SlSIP1L12基因的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯變化：2 h后SlSIP1L12表達(dá)水平逐步提高，8 h后達(dá)到最高，為初始表達(dá)量的4.6倍。初步預(yù)測(cè)，SlSIP1L12是ABA下游的響應(yīng)基因。圖5-B顯示，在接受機(jī)械損傷誘導(dǎo)時(shí)，SlSIP1L12的表達(dá)水平相比對(duì)照較穩(wěn)定；而脫水脅迫時(shí)，SlSIP1L12的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，處理2 h后，SlSIP1L12基因的表達(dá)水平開始提高，36 h后，它的表達(dá)量最高，是初始水平的8.9倍。綜上所述，SlSIP1L12基因的功能可能與ABA的響應(yīng)有關(guān)。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

經(jīng)轉(zhuǎn)基因鑒定，獲得6個(gè)沉默株系（圖6），沉默效率為64%～83%，而沉默效率最高的株系RNAi-13未結(jié)出果實(shí)。因此選擇沉默效率相對(duì)較高的2個(gè)株系RNAi-4和RNAi-5作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

圖 4 AC++不同組織中SlSIP1L12的表達(dá)模式Fig. 4 Expressions of SlSIP1L12 in different tissues of AC++

圖 5 不同處理下SlSIP1L12基因的表達(dá)模式分析Fig. 5 Expressions of SlSIP1L12 under treatments by different stimuli

圖 6 轉(zhuǎn)基因不同株系中SlSIP1L12的表達(dá)水平Fig. 6 Expressions of SlSIP1L12 in RNAi-SlSIP1L12 lines

圖 7 轉(zhuǎn)基因植株和AC++種子的發(fā)芽試驗(yàn) Fig. 7 Seed germination of transgenic and control plants

2.5 種子發(fā)芽情況的鑒定

本研究證實(shí)SlSIP1L12基因的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，而ABA對(duì)種子萌發(fā)有顯著的抑制作用，推測(cè)抑制SlSIP1L12表達(dá)可提高種子萌發(fā)速度。轉(zhuǎn)基因及對(duì)照番茄種子培養(yǎng)4 d后，RNAi-4和RNAi-5株系種子開始萌發(fā)，5～7 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系種子的胚根進(jìn)入迅速萌發(fā)期，9 d后發(fā)芽率趨于穩(wěn)定。而番茄AC++種子7 d后才開始萌發(fā)，7～9 d為快速萌發(fā)期，10 d后發(fā)芽率趨于穩(wěn)定（圖7-A）。在種子萌發(fā)7 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的胚根長(zhǎng)度是對(duì)照的10～15倍（圖7-B、7-C）。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)速度比對(duì)照快2 d左右。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽速度快的機(jī)理研究

為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)速度快的原因，本研究檢測(cè)了依賴于ABA信號(hào)途徑的AREB基因和不依賴于ABA的DREB基因的表達(dá)水平[13]。圖8-A證實(shí)，2個(gè)基因表達(dá)均受到了抑制，說(shuō)明SlSIP1L12基因的沉默抑制了植株體內(nèi)ABA響應(yīng)。進(jìn)一步分析種子萌發(fā)7 d后ABA的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子體內(nèi)ABA的含量顯著降低（圖8-B）。因此，進(jìn)一步證實(shí)了SlSIP1L12基因調(diào)控種子萌發(fā)的機(jī)理與ABA響應(yīng)有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

Trihelix轉(zhuǎn)錄因子SIP1亞家族含有保守的Trihelix結(jié)構(gòu)域（前2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的N端是保守的色氨酸，第三個(gè)螺旋的保守色氨酸被異亮氨酸取代）、第四螺旋和α-螺旋中心結(jié)構(gòu)域[14]。SIP1蛋白保守區(qū)比對(duì)結(jié)果顯示，SlSIP1L12屬于SIP1亞家族（圖2），但序列一致性分析證實(shí)，SIP1亞家族蛋白間的氨基酸一致性較低，說(shuō)明了SIP1蛋白間保守區(qū)的序列一致性較強(qiáng)，但保守區(qū)以外的序列分化較明顯。沉默株系植株的表型分析說(shuō)明，該基因與NtSIP1的功能相似[1]。而SlSIP1L12是否為6b的互作因子待進(jìn)一步證實(shí)。

植物激素ABA誘導(dǎo)或抑制了許多下游基因的表達(dá)變化，而下游基因轉(zhuǎn)錄水平的改變對(duì)ABA響應(yīng)及其相關(guān)生理作用有一定的干擾或促進(jìn)作用，進(jìn)而改變植物的生長(zhǎng)或適應(yīng)能力[15?16]。本研究在進(jìn)行激素和非生物脅迫處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)SlSIP1L12響應(yīng)ABA和脫水脅迫的誘導(dǎo)（圖5）。因此推測(cè)，SlSIP1L12是ABA下游的響應(yīng)基因，沉默SlSIP1L12的表達(dá)可能抑制植物對(duì)ABA響應(yīng)。轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證實(shí)，沉默株系的種子萌發(fā)速度比對(duì)照快2 d左右；發(fā)芽7 d后，轉(zhuǎn)基因株系胚根的長(zhǎng)度是對(duì)照的10倍左右（圖7）。通常種子的萌發(fā)分為三個(gè)階段：吸水期、代謝期和萌發(fā)期。后兩個(gè)發(fā)育階段必然會(huì)受到激素的調(diào)控作用[17-18]。DREB為不依賴于ABA的脅迫誘導(dǎo)基因，AREB為依賴于ABA的脅迫誘導(dǎo)基因[19]。而試驗(yàn)結(jié)果表明，AREB和DREB的表達(dá)水平均受到顯著抑制，說(shuō)明抑制SlSIP1L12的表達(dá)除了降低ABA響應(yīng)外，還改變了非ABA響應(yīng)，其調(diào)控作用有待深入探索（圖8）。此外，相同條件下，轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)速度快于AC++的原因可能與ABA的響應(yīng)受到抑制有關(guān)。進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)，發(fā)芽期間ABA的含量顯著低于對(duì)照（圖8），說(shuō)明SlSIP1L12正調(diào)控了ABA的合成，但SlSIP1L12基因參與ABA信號(hào)途徑的機(jī)制，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖 8 沉默株系內(nèi)下游基因與相關(guān)激素的檢測(cè)Fig. 8 Expressions of downstream genes in transgenic and control plants

種子萌發(fā)與否與內(nèi)源激素ABA和GA的平衡密切相關(guān)，ABA促進(jìn)種子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成與脫水耐性，而GA促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分的分解[20]。本研究中，SlSIP1L12基因的表達(dá)受到ABA和脫水脅迫的雙重誘導(dǎo)，而不響應(yīng)GA3的誘導(dǎo)（圖5），因此推測(cè)，SlSIP1L12的基因功能與ABA途徑關(guān)系較密切。然而，GA與ABA存在許多交互作用，且乙烯、油菜素內(nèi)酯、含氮化合物等激素也經(jīng)常貫穿其中，并影響二者的作用[20]，因此，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)ABA響應(yīng)基因表達(dá)或種子體內(nèi)ABA含量的變化只是初步的驗(yàn)證，ABA與GA激素的互作機(jī)制將在后續(xù)的研究中深入分析。

本研究克隆到Trihelix轉(zhuǎn)錄因子SIP1亞家族基因SlSIP1L12全長(zhǎng)為1 125 bp。該基因主要在地上部分表達(dá)，可受ABA與脫水脅迫誘導(dǎo)。利用RNAi技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株 葉片中，ABA響應(yīng)基因的表達(dá)顯著受到抑制；轉(zhuǎn)基因植株種子的發(fā)芽速度快于對(duì)照，且發(fā)芽7 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因種子體內(nèi)ABA含量明顯小于對(duì)照。