李季東，楊祥燕，蔡元保，李 穆，曾黎明，黃思婕，巫輔民，林玉虹，鄭文武，黃錦媛

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院/廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001）

0 引言

【研究意義】低溫、干旱、洪澇、鹽堿等逆境脅迫是嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育的環(huán)境因子，可導(dǎo)致植物產(chǎn)量和品質(zhì)下降甚至死亡。植物通過細(xì)胞功能調(diào)節(jié)來抵御外界環(huán)境的逆境脅迫，尤其是蛋白質(zhì)可逆磷酸化在細(xì)胞的新陳代謝、生長發(fā)育、增殖與凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1?2]，而蛋白質(zhì)可逆磷酸化主要由蛋白磷酸酶和蛋白激酶來平衡調(diào)控。因此，蛋白磷酸酶的功能研究對于了解蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程及植物耐逆機制研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】蛋白質(zhì)磷酸酶分為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、雙特異性蛋白磷酸酶、酪氨酸磷酸酶3類，其中絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（PP）又分為蛋白磷酸酶1（PP1）和蛋白磷酸酶2（PP2）[3]。目前，國內(nèi)外對PP2家族蛋白的生物學(xué)功能比較清楚，如番茄（Solanum lycopersicum）LePP2Ac、水 稻（Oryza sativa）OsPp2a、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）AthPP2CA和玉米（Zea mays）ZmPP2C等[4?5]；而對PP1家族蛋白的功能研究并不多，這個家族成員包括歐洲油菜（Brassica napus）BnPP1、野大豆（Glycine soja）GsPP1、豌豆（Pisum sativum）PsPP1和橙子（Citrus sinensis）CsPP1等[6]。PP1家族蛋白主要作用于磷酸酶激酶的β亞單位，其活性主要受內(nèi)源熱穩(wěn)定蛋白I-1和I-2的抑制[7]。雖然從模式植物擬南芥、水稻、煙草、苜蓿、豌豆等多種植物的基因組DNA或cDNA文庫中都分離到編碼PP1蛋白催化亞基的基因[6?8]，但是對于這些基因的功能及其編碼蛋白的催化機制人們并不清楚。澳洲堅果又稱夏威夷果，是山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（Macadamia）植物，原產(chǎn)于亞熱帶雨林，具有重要的營養(yǎng)價值和藥用價值，享有“干果皇后”的美譽。雖然澳洲堅果在澳大利亞、美國夏威夷、肯尼亞和中國等地廣泛種植，但是受其生長條件的限制，澳洲堅果無法進一步推廣種植[9?10]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外仍未見澳洲堅果蛋白質(zhì)磷酸酶的相關(guān)研究報道。在澳洲堅果抗寒轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR克隆澳洲堅果蛋白磷酸酶基因，并利用生物信息學(xué)分析這些蛋白磷酸酶的結(jié)構(gòu)和功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于前期的研究基礎(chǔ)[11]，本研究從澳洲堅果光殼種中克隆編碼蛋白磷酸酶基因MiSTPP1和MiSTPP4，并對其進行生物信息學(xué)分析，以期為深入研究澳洲堅果PP1家族蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及闡明其耐逆的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為廣西亞熱帶作物研究所澳洲堅果種質(zhì)資源圃提供的澳洲堅果光殼種（Macadamia integrifolia）品 種Own Choice（O.C.）。對 接 穗 為4個月苗齡的嫁接苗進行4 ℃低溫處理0.5、1、3、6、12、24 h，采集這些低溫處理后的幼嫩葉片，液氮 速凍處理后?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照蔡元保等[12]的CTAB改良法提取澳洲堅果葉片總RNA，利用核酸蛋白檢測儀分析所提取的總RNA純度和濃度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA完整性，按照美國Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Transcription System）說明書合成澳洲 堅果cDNA。

1.3 澳洲堅果的MiSTPP1和MiSTPP4基因克隆

利用本課題組從澳洲堅果抗寒轉(zhuǎn)錄組中獲得2個蛋白磷酸酶基因，利用Primer Premier 5.0軟件在這2個基因開放閱讀框（ORF）以外的區(qū)域設(shè)計引物MiSTPP1-F和MiSTPP1-R，以及MiSTPP4-F和MiSTPP4-R（表1）。所用引物全部由大連寶生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系15 μL，包括澳洲堅果cDNA模板1.0 μL，2×Ex Taq PCR MasterMix 8.0 μL，正向和反向引物各0.5 μL，無菌ddH2O補足至15 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，52.0 ℃或55.2 ℃（具 體 參 考 表1）30 s，72 ℃ 90 s，32個 循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209-02）進行回收與純化，將其連接到T載體pMD18上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并采用藍(lán)白斑篩選方法挑取白色陽性克隆，送至上海 生工生物工程有限公司進行序列測序。

表 1 基因MiSTPP1和MiSTPP4克隆所用引物序列Table 1 Primer sequences used in cloning MiSTPP1 and MiSTPP4

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行蛋白質(zhì)序列和功能結(jié)構(gòu)域的同源檢索，用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進行開放閱讀框ORF分析，用PROSITE（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）軟件預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域，用ProtParam軟件（http://web.expasy.org/protparam/）分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，用在線程序NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測磷酸化位點，用PSORT軟件（http://www.psort.org）分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，用SignalP 4.1軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白信號肽，用TMpred軟件（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜域，用SOPMA軟件（http://www.expasy.org）進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，用在線程序SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。在NCBI網(wǎng)站GenBank中查找同源蛋白，并用DNAMAN 6.0軟件進行同源蛋白的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅果MiSTPP1和MiSTPP4基因的cDNA全長克隆

以澳洲堅果葉片cDNA為模板，采用特異性引物MiSTPP1-F和MiSTPP1-R，以及MiSTPP4-F和MiSTPP4-R分別擴增2個基因的開放閱讀框（ORF）（圖1）。測序結(jié)果表明，澳洲堅果MiSTPP1基因的cDNA全長為2 119 bp，ORF長度為1 053 bp，編碼350個氨基酸；MiSTPP4基因的cDNA全長為2 030 bp，ORF長度為981 bp，編碼326個氨基酸。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序檢索同源蛋白的結(jié)果表明，這2個基因的編碼蛋白和其他物種的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP1具有很高的序列相似性。因此，將這2個基因分別命名為澳洲堅果的MiSTPP1和MiSTPP4基因，GenBank登錄號分別為MT374548和MT374551。

圖 1 澳洲堅果MiSTPP1和MiSTPP4基因的克隆Fig. 1 Isolations of MiSTPP1 and MiSTPP4 from M. integrifolia

2.2 MiSTPP1和MiSTPP4氨基酸序列的同源性分析

氨基酸多序列比對和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，澳洲堅果MiSTPP1和MiSTPP4與其他植物來源的蛋白磷酸酶PP1家族成員的蛋白序列具有極高的相似度（圖2）。其中，MiSTPP1蛋白與水芙蓉NnPP1（XP_010259515）、歐洲油菜BnPP1（XP_013643938）、蕪菁BrPP1（XP_009151182）的氨基酸序列相似度分別為86.29%、83.72%和83.39%；MiSTPP4蛋白與雞血藤SsPP1（TKY61334）、鷹嘴豆CaPP1（XP_00449 5569）、蒺藜苜蓿MtPP1-1（AES61198）的氨基酸序列相似度分別為92.02%、91.72%和91.41%。這些蛋白都含有N端的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶特征序列LRGNHE及蛋白磷酸酶PP1家族的典型結(jié)構(gòu)域MPP_PP1_PPKL。

2.3 MiSTPP1和MiSTPP4的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（PP）家族的系統(tǒng)進化樹（圖3）顯示，PP家族分為PP1家族和PP2家族，其中，PP1家族成員又分成2個組，澳洲堅果MiSTPP1和MiSTPP4被分在不同的組內(nèi)，其中MiSTPP1與水芙蓉NnPP1（XP_010259515）和罌粟PsPP1（XP_026450203）的親緣關(guān)系最近；MiSTPP4與橙子CsPP1（XP_006487724）和雞血藤SsPP1（TKY61334）的親緣關(guān)系最近，推測這些親緣關(guān)系近的PP1蛋白具有相同的進化起源及類似的結(jié)構(gòu)和功能。

2.4 MiSTPP1和MiSTPP4蛋白的基本理化性質(zhì)分析

ProtParam軟件分析MiSTPP1蛋白的結(jié)果表明，其相對分子質(zhì)量為39.57 kDa，分子式C1 764H2 747N475O524S18，等電點（pI）為5.14，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為49個，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為36個，不穩(wěn)定系數(shù)為50.03（為不穩(wěn)定蛋白），脂肪族指數(shù)為90.54，親水性總平均值（GRAVY）為?0.274。因此，推測MiSTPP1蛋白是一個不穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖 2 MiSTPP1和MiSTPP4與其他植物PP1蛋白的同源性比對結(jié)果Fig. 2 Homology between MiSTPP1, MiSTPP4, and other PP1 proteins

圖 3 MiSTPP1和MiSTPP4與其他植物PP蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系Fig. 3 Relationship among phylogenetic trees of MiSTPP1, MiSTPP4, and other PP proteins

ProtParam軟件分析MiSTPP4蛋白的結(jié)果表明，其相對分子質(zhì)量為36.74 kDa，分子式為C1 646H2 579N439O478S18，等電點（pI）為5.75，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為42個，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為37個，不穩(wěn)定系數(shù)為36.77（為穩(wěn)定蛋白），脂肪族指數(shù)為92.09，親水性總平均值（GRAVY）為?0.178。因此，推測M iSTPP4蛋白是一個穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.5 MiSTPP1和MiSTPP4蛋白的功能預(yù)測

在線程序NetPhos 3.1預(yù)測結(jié)果表明，MiSTPP1蛋白有23個磷酸化位點，其中絲氨酸（Serine）13個，蘇氨酸（Threonine）7個，酪氨酸（Tyrosine）3個；MiSTPP4蛋白有20個磷酸化位點，其中絲氨酸（Serine）8個，蘇氨酸（Threonine）9個，酪氨酸（Tyrosine）3個。PSORT軟件預(yù)測表明，MiSTPP1和MiSTPP4蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)可能性都為65%。SignalP和TMpred軟件預(yù)測顯示，MiSTPP1和MiSTPP4蛋白都不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，都為非分泌蛋白和非跨膜蛋白。

2.6 MiSTPP1和MiSTPP4蛋白的二級和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

SOPMA軟件分析結(jié)果表明，澳洲堅果MiSTPP1多肽鏈中主要含有無規(guī)則卷曲（38.57%）和α-螺旋（36.57%），其次是折疊延伸鏈（18.29%）和β-轉(zhuǎn)角（6.57%）（圖4-A）；MiSTPP4多肽鏈中主要含有α-螺旋（42.02%）和無規(guī)則卷曲（36.50%），其次是折疊延伸鏈（14.42%）和β-轉(zhuǎn)角（7.06%）（圖4-B）。

圖 4 MiSTPP1蛋白（A）和MiSTPP4蛋白（B）的二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Secondary structure of MiSTPP1 (A) and MiSTPP4 (B)

以絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP1的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1s70.1.A）為同源模板，利用Swiss-model軟件構(gòu)建MiSTPP1蛋白的三維預(yù)測模型。結(jié)果表明，MiSTPP1蛋白的氨基酸序列與模板序列一致性為69.55%，GMQE值為0.78，其核心結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋組成（圖5-A）。同樣，以絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP1的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6dcx.2.A）為同源模板，利用Swiss-model軟件構(gòu)建MiSTPP4蛋白的三維預(yù)測模型。結(jié)果表明，MiSTPP4蛋白的氨基酸序列與模板序列一致性為76.42%，GMQE值為0.83，其核心結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲組成（圖5-B）。MiSTPP1和MiSTPP4蛋白的三維模型組分與其二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相符合。

圖 5 MiSTPP1蛋白（A）和MiSTPP4蛋白（B）的三維結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 3D configurations of MiSTPP1 (A) and MiSTPP4 (B)

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP1家族成員在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝、生長與凋亡等多種細(xì)胞生理生化過程中廣泛表達，且其蛋白序列與結(jié)構(gòu)在長期進化中也高度保守[13]。本研究利用本課題組澳洲堅果抗寒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，通過RT-PCR技術(shù)成功獲得了屬于PP1基因家族的澳洲堅果MiSTPP1和MiSTPP4基因cDNA全長。蛋白序列和系統(tǒng)進化樹分析表明，MiSTPP1和MiSTPP4蛋白與其他植物PP1蛋白具有極高的序列相似度，都屬于PP1進化分支，都含有PP1家族的典型結(jié)構(gòu)域MPP_PP1_PPKL，尤其是N端都含有絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶特征序列LRGNHE。這些為MiSTPP1和MiSTPP4蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究提供氨基酸序列基礎(chǔ)。

蛋白基本理化性質(zhì)分析表明，MiSTPP1蛋白是一個不穩(wěn)定的親水性蛋白，而MiSTPP4蛋白是一個穩(wěn)定的親水性蛋白。蛋白磷酸化位點分析表明，MiSTPP1蛋白以絲氨酸磷酸化為主，而MiSTPP4蛋白以絲氨酸和蘇氨酸磷酸化為主，結(jié)合磷酸化修飾在蛋白功能中的作用[14?15]，推測這兩類氨基酸進行磷酸化修飾時在各自蛋白行駛功能中發(fā)揮重要的作用。蛋白亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測表明，MiSTPP1和MiSTPP4蛋白極可能定位于細(xì)胞質(zhì)，推測這兩個蛋白作為非分泌蛋白或非跨膜蛋白行駛其生物學(xué)功能。蛋白二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)分析表明，MiSTPP1和MiSTPP4蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲組成，并夾雜著折疊延伸鏈，尤其是預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)模型與PP1家族已知的晶體結(jié)構(gòu)具有極高的一致性（分別達到69.55%和76.42%）。說明PP1蛋白在長期的物種進化過程中，MiSTPP1和MiSTPP4蛋白同其他PP1家族成員一樣，其蛋白的空間結(jié)構(gòu)高度保守，推測其有類似的生物學(xué)功能。

鑒于MiSTPP1和MiSTPP4蛋白與其他功能已知的PP1家族成員具有極高的親緣關(guān)系和空間結(jié)構(gòu)相似性，可以初步推測MiSTPP1和MiSTPP4基因在響應(yīng)逆境脅迫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育等生理生化過程中發(fā)揮重要的作用。但是，其具體的功能還需要通過亞細(xì)胞定位、酵母自激活及遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)進行深入研究，從而為闡明澳洲堅果PP1蛋白的分子調(diào)控機制提供科學(xué)依據(jù)。