江錦秀，張靖鵬，林裕勝，游 偉，胡奇林

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

【研究意義】山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（enzootic nasal tumor，ENT）是一種由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2）引起的慢性接觸性傳染病，以患病山羊流鼻液，剖檢可見鼻腔內(nèi)的類似菜花狀腫瘤為特征[1]。ENT在我國內(nèi)蒙古、陜西、四川、重慶、福建等地均有報道[2?8]?！厩叭搜芯窟M展】多數(shù)學者認為由于山羊基因組中整合了內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒使得山羊?qū)NTV-2病毒產(chǎn)生免疫耐受，導致無法在患病山羊血清內(nèi)檢測到抗體。ENTV-2是逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有相互重疊的gag、pro、pol、env編碼基因，以及長末端重復序列LTR。gag基因編碼衣殼蛋白，是逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的群抗原。Pro基因編碼蛋白酶，pol基因編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，env基因編碼囊膜糖蛋白。囊膜蛋白被切割成跨膜蛋白（Transmembrane protein, TM）和位于ENTV囊膜表面的表面蛋白（Surface protein, SU）?！颈狙芯壳腥朦c】SU含有眾多的抗原位點，可誘導宿主產(chǎn)生中和抗體[9?10]。SU可以與宿主細胞的Hyal-2 受體結(jié)合，在ENTV感染宿主細胞的過程中起到重要作用[11]。表達ENTV-2FJ病毒株的SU蛋白將對了解ENTV-2的感染和致瘤機制以及建立診斷方法提供基礎(chǔ)?！緮M解決關(guān)鍵問題】本試驗提取ENTV-2FJ病毒株的RNA，通過RT-PCR方法獲得了編碼SU蛋白的基因序列，克隆至原核表達質(zhì)粒pET-32a（+），獲得原核表達質(zhì)粒pET-32a（+）-SU，在RosettagamiB中進行SU蛋白表達；將純化的SU蛋白免疫小鼠，制備了小鼠抗SU蛋白的多克隆抗體，為進一步研究SU蛋白在ENTV-2感染中的作用以及建立檢測方法提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ECO RⅠ和Hin d Ⅲ內(nèi)切酶購自NEB公司；Easypure Viral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GoScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo（dT）購自Promega；pMD-19T載體、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、E. coli DH5α Competent Cells、DL2000 DNA marker、2ⅹprotein loading buffer、Protein MW Marker（Low）均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；RosettagamiB（DE3）感 受 態(tài) 細 胞、IPTG、X-gal、WB BSA 封閉液體（1X in PBS）、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；Goat anti-mouse IgG（H+L）, HRP conjugate, ELISA and WB購自Proteintech；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；SPF級Balb/c小鼠購自福州吳氏動物；ENTV-2純化病毒以及ENTV-2多克隆抗體由福建省農(nóng)業(yè)科學院草食動物病研究室保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù) GenBank 中收錄的 ENTV-2FJ株（登錄號：MK559457）的env基因序列，利用 Primer 6.0 軟件設(shè)計用于擴增 ENTV-2FJ SU基因的引物，下劃線處為酶切位點，預期擴增長度為 1 161 bp（表1）。引物由上海生工生物有限公司合成。

表 1 引物設(shè)計Table 1 Primer design

1.3 SU基因的克隆載體及原核表達載體的構(gòu)建

利用 Easypure Viral DNA/RNA Kit試劑盒提取ENTV-2總 RNA，以RNA 為模板，用 RT-PCR 擴增 SU基因片段。反轉(zhuǎn)錄體系和程序參考GoScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo（dT）試劑盒說明書。PCR體系參見寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase的說明書。PCR程序設(shè)置為98 ℃10 S，55 ℃ 5 S，72 ℃ 30 S，共30循環(huán)。將PCR膠回收產(chǎn)物加A尾后連接pMD-19T，測序正確的陽性質(zhì)粒和pET-32a（+）表達載體分別用 EcoRⅠ和 Hind III 進行雙酶切。酶切產(chǎn)物回收純化后，用T4 DNA ligase連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序分析驗證后命名為 pET-32a（+）-SU。

1.4 重組蛋白ENTV-2FJ SU的誘導表達

pET-32a（+）-SU按 常 規(guī) 轉(zhuǎn) 化 RosettagamiB（DE3）感受態(tài)細胞，對其IPTG誘導濃度（終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L?1）及誘導時間（3 、4 、5 、6 h，過夜）和誘導溫度（20 、25 、30 、37 ℃）進行優(yōu)化。以pET-32a（+）空載轉(zhuǎn)化RosettagamiB（DE3）感受態(tài)細胞作為對照。誘導表 達 蛋 白 樣 品 經(jīng) 過 處 理（12 000 r·min?1離 心，4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀用PBS重懸，菌體沉淀加入PBS，冰浴超聲20 min，破碎菌體。12 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，分別收集上清和沉淀），后經(jīng)SDS-PAGE（10%分離膠）分析。

1.5 重組蛋白 ENTV-2FJ SU的純化

重組蛋白ENTV-2FJ SU大量誘導表達后，10 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀用PBS重懸，10 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，棄上清，重復3次。菌體沉淀加入PBS，冰浴超聲20 min，破碎菌體。12 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，收集沉淀，用含2 mol·L?1尿素的PBS重懸，12 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，棄上清，重復此步驟3次，沉淀加入含8 mol·L?1尿素的PBS重懸，冰浴超聲，溶解包涵體。加入4ⅹ protein loading Buffer煮沸5 min，經(jīng)SDS-PAGE電泳后切膠回收目的條帶，研磨后浸泡于PBS中，4 ℃過夜，離心取上清。

1.6 動物免疫和多克隆抗體的制備

取純化的 SU 蛋白以及ENTV-2FJ 純化病毒分別與等量佐劑混合，超聲乳化，皮下多點注射 Balb/c小鼠，第 1 次用弗氏完全佐劑，蛋白劑量為70 μg·只?1，之后2次免疫間隔時間均為2周，后2次免疫用弗氏不完全佐劑，蛋白劑量為100 μg·只?1；在第 3 次免疫后的第9 d，小鼠斷尾采血，分離血清，檢測抗體水平。待抗體水平達到要求時采血分離血清，保存于?20 ℃。

1.7 Western-blot 分析

對純化的ENTV-2FJ病毒進行SDS-PAGE分析后，采用半干法轉(zhuǎn)膜。將制備的小鼠抗SU蛋白多克隆抗體、小鼠抗ENTV-2多克隆抗體和正常對照小鼠血清分別作為一抗，Goat anti-mouse IgG（H+L），HRP conjugate，ELISA and WB為二抗（使用濃度1∶2 000），進Western-blot試驗。

1.8 ELISA試驗

分別以純化SU重組蛋白、純化ENTV-2病毒作為包被抗原，以鼠抗SU多克隆抗體以及鼠抗ENTV-2多克隆抗體為一抗（一抗以1∶4開始倍比稀釋至1∶32），HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗（使用濃度1∶12 000），進行ELISA試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 擴增和重組質(zhì)粒的鑒定

RT-PCR 擴增得到約1 161 bp 的目的片段，結(jié)果見圖1。將目的片段連接pMD-19T，獲得SU-19T質(zhì)粒，送福州鉑尚生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果與ENTV-2FJ株的SU基因序列對比，同源性高達100.0%，表明目的基因擴增正確。

圖 1 SU基因RT-PCR擴增結(jié)果Fig. 1 RT-PCR amplification result of SU gene

2.2 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

SU-19T質(zhì)粒用 EcoRⅠ和 Hind III 進行雙酶切，SU-19T質(zhì)粒雙酶切后分別獲得約1 161 bp（目的條帶）和2 692 bp（pMD-19T載體）的2條帶（圖2），與預期條帶大小基本一致。pET-32a（+）空載也用EcoRⅠ和 Hind III 進行雙酶切，獲得約5 900 bp的條帶（圖3）。分別切膠回收目的片段和pET-32a（+）載體片段進行連接，連接后的重組質(zhì)粒送福州鉑尚生物技術(shù)公司測序驗證。

圖 2 SU-19T質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig. 2 Double digestion result of SU-19T plasmid

圖 3 PET32 a（+）質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig. 3 Double digestion result of PET32 a（+）

2.3 重組蛋白ENTV-2FJ SU誘導表達條件的優(yōu)化

以不同濃度的 IPTG 對菌體誘導過夜，離心收集菌液，超聲并制備樣品，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳。結(jié)果顯示，當IPTG 終濃度為 0.4～1.2 mmol·L?1時，重組蛋白SU表達量大且無明顯差異（圖4）。IPTG的終濃度均為1.0 mmol·L?1時，設(shè)置不同的誘導時間， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導3 、4 、5 、6 h以及過夜誘導后重組SU蛋白的表達量相差不大（圖5），使用20、25、30、37 ℃ 4種不同溫度誘導，SU蛋白均以包涵體形式表達，菌液上清中有少量SU蛋白表達，而 pET-32a（+）空載體誘導對照組則沒有重組蛋白的表達。

圖 4 不同IPTG誘導濃度對SU重組蛋白誘導表達的影響Fig. 4 Effect of IPTG at different concentrations on the induced expression of SU recombinant protein

圖 5 不同IPTG誘導時間對SU重組蛋白誘導表達的影響Fig. 5 Effect of different IPTG induction time on the expression of SU recombinant protein

2.4 重組蛋白ENTV-2FJ SU 的純化

pET-32a（+）-SU誘導表達后的樣品經(jīng)過處理，經(jīng)SDS-PAGE后顯示目的蛋白大小約64 KD，切膠回收目的條帶（圖6）用于蛋白免疫。

2.5 Western-blot 分析結(jié)果

Western-blot分析結(jié)果顯示，重組SU蛋白多克隆抗體能與ENTV-2FJ抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，出現(xiàn)大

圖 6 SU重組蛋白純化結(jié)果Fig. 6 The purification result of SU fusion protein

小為64 KD的條帶（圖7-C），ENTV-2FJ多克隆抗體與ENTV-2FJ抗原發(fā)生特異性反應(yīng)（圖7-B），條帶與ENTV-2FJ病毒SDS-PAGE膠分析結(jié)果（另文報道[8]）一致，ENTV-2病毒與正常小鼠的血清無特異性條帶出現(xiàn)（圖7-A）。

圖 7 Western-blot 分析結(jié)果Fig. 7 The result of Western-blot analysis

2.6 ELISA結(jié)果

以純化SU重組蛋白、純化ENTV-2病毒作為包被抗原（病毒含量20 μg·L?1、100 μL·孔?1），以鼠抗SU多克隆抗體以及鼠抗ENTV-2多克隆抗體為一抗進行ELISA，結(jié)果如表2所示，SU蛋白抗原與鼠抗SU多克隆抗體以及鼠抗ENTV-2多克隆抗體均呈陽性反應(yīng)；ENTV-2抗原與鼠抗ENTV-2多克隆抗體、鼠抗SU多克隆抗體（1∶4）呈陽性反應(yīng)。

表 2 ELISA試驗結(jié)果Table 2 ELISA result

3 討論與結(jié)論

SU蛋白可以與宿主細胞的Hyal-2受體結(jié)合，并通過結(jié)合這一識別過程介導病毒對細胞的轉(zhuǎn)化[11]。JSRV缺失SU的信號肽到SU與TM的連接區(qū)域也使env喪失轉(zhuǎn)化能力，表明SU蛋白中可能有多個區(qū)域參與細胞轉(zhuǎn)化[12]。而張月梅等[13?14]構(gòu)建了SU蛋白缺失型真核表達載體, 轉(zhuǎn)染293T細胞，運用激光共聚焦結(jié)合免疫共沉淀方法確定SU蛋白和Hya-2蛋白可能結(jié)合區(qū)域，結(jié)果表明SU基因所缺失區(qū)域238～867 bp對于SU蛋白與Hya-2蛋白的結(jié)合是必不可少的。研究SU蛋白對了解ENTV的免疫特性及致病機制具有重要意義。本研究成功表達了ENTV-2FJ 的SU蛋白，用純化的重組SU蛋白免疫小鼠，獲得了小鼠抗SU蛋白多克隆抗體；Western-blot分析結(jié)果顯示獲得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗體可以與ENTV-2病毒抗原特異性結(jié)合，另外ELISA試驗也顯示不僅ENTV-2抗原可與抗SU多克隆抗體反應(yīng)，SU抗原也可以與抗ENTV-2多克隆抗體反應(yīng)，表明SU重組蛋白具有免疫原性。SU重組蛋白的表達為ENTV-2單克隆抗體的制備以及ELISA方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

本研究中，ENTV-2抗原與1:4鼠抗SU多克隆抗體反應(yīng)呈陽性，而與1:8鼠抗SU多克隆抗體不反應(yīng)，說明筆者制備的抗SU重組蛋白抗體與ENTV-2反應(yīng)原性較弱，可能與該蛋白在純化過程中變性后復性和重折疊不好，影響了蛋白的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。下一步筆者將優(yōu)化該SU重組蛋白的復性和重折疊方案，以改善其反應(yīng)原性。