洪森榮，鄧雨晴，吳洪婷，陳 婷，郭淑貞，楊于萱，蔡 紅，陳榮華

（1. 上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2. 上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001；3. 上饒市薯芋類(lèi)作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001；4. 上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；5. 上饒市紅日農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，江西 上饒 334700）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬（Solanum L.）雙子葉一年生植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是全球僅次于水稻、小麥、玉米的第四主糧作物，是全球最重要的塊莖類(lèi)作物，也是重要的糧菜兼用作物和工業(yè)原料[1?2]。馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)豐富，可實(shí)現(xiàn)周年供應(yīng)，可作糧用、菜用、飼用[3]。玉米、小麥、水稻易受限于氣候、水肥等條件，而馬鈴薯在偏遠(yuǎn)缺水地區(qū)仍可實(shí)現(xiàn)豐產(chǎn)，且產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)前景廣闊，是我國(guó)脫貧攻堅(jiān)的助力產(chǎn)業(yè)[3]。中國(guó)是第一大馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，在緩解我國(guó)食物壓力、保障我國(guó)糧食安全方面作用突出[3]。高山馬鈴薯食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，管理成本和種植技術(shù)低，且高山馬鈴薯對(duì)高山地區(qū)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可在高海拔山區(qū)推廣種植，具有較強(qiáng)的產(chǎn)業(yè)化潛力[4]。江西懷玉山屬于高海拔高山地區(qū)，紫外線強(qiáng)烈，晝夜溫差大，馬鈴薯品種應(yīng)選擇早熟型，如懷玉山高山馬鈴薯（S. tuberosum L.cv. Huaiyushan）[5]。懷玉山高山馬鈴薯，又稱(chēng)麻籽洋芋，國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品（2013年）。懷玉山高山馬鈴薯藥食兼優(yōu)。食用，形橢圓，具麻點(diǎn)，色黃肉白（屬于外觀品質(zhì)），營(yíng)養(yǎng)豐富，切后不黑，味甘爽口，實(shí)為一道天然美味佳肴；藥用，不含還原糖，富含膳食纖維，可和中養(yǎng)胃、健脾利濕、降糖降脂、美容養(yǎng)顏、防治胃癌[6]。蔗糖是運(yùn)輸和貯存光合碳水化合物的主要形式，是植物糖代謝的中心調(diào)控樞紐[7]。蔗糖合酶（Sucrose synthase，SuSy）可分解蔗糖，也可合成蔗糖，具有雙重屬性[8]，主要參與植物韌皮部代謝、碳源分配、纖維素和淀粉合成，還可影響植物抗逆性、種子發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)形成、生殖生長(zhǎng)、糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生物固氮能力，為植物體生長(zhǎng)發(fā)育提供碳源和能量動(dòng)力[9]。因此，分析懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶的核酸序列信息，預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)進(jìn)一步揭示該酶生物學(xué)功能具有重要指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】目前已在蘋(píng)果[10]、苦蕎[11]、毛白楊[12]、木薯[13]和白及[14]等多種高等植物中分離得到了蔗糖合酶基因。而關(guān)于懷玉山高山馬鈴薯的研究主要集中于全基因組重測(cè)序分析[15]、轉(zhuǎn)錄組分析[5]、DNA甲基化MSAP分析[6]、遺傳多樣性同工酶分析[16]、脫毒方法[17]和病毒DAS-ELISA檢測(cè)與分析[18]等研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】但有關(guān)懷玉山馬鈴薯蔗糖合酶基因結(jié)構(gòu)與功能的研究還未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)從構(gòu)建的懷玉山馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選蔗糖合酶基因序列（SuSy 4，PDSC Gene ID：PGSC0003DMG400002895，PDSC Transcript ID：PGSC0003DMT400007506，iTAG Transcript ID：Sotub12g008670.1.1，NCBI Reference Sequence/GenBank：M18745.1，Locus At：At3g43190），利用在線生物信息學(xué)分析軟件分析蔗糖合酶基因序列的氨基酸序列、理化性質(zhì)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位，為分析蔗糖合酶保守結(jié)構(gòu)域提供基礎(chǔ)資料，為馬鈴薯蔗糖合酶的進(jìn)一步研究提供生物信息學(xué)方面的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

懷玉山高山馬鈴薯試管苗（上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供）、Trizol總RNA提取試劑、PCR反應(yīng)2×GoldStarTaqMasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；M-MLV cDNA第一鏈合成試劑、PrimeScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）、PMD18-T vector及SYBR? Premix Ex TaqTM II均購(gòu)自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌（E. coli）DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存；其 他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑提取懷玉山高山馬鈴薯試管苗的總RNA，提取步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M-MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因的克隆 利用懷玉山高山馬鈴薯試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到蔗糖合酶基因的核心片段（CDS全長(zhǎng)），運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因特異性引物（F：ATGGCTGAA CGTGTTCTGACTC；R：TCACTCAGCAGCCAATGGA AC）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì) 粒送往上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因的生物信息學(xué)分析 按照張林等[19]的方法對(duì)懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶進(jìn)行氨基酸序列分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、功能分析。使用BioEdit軟件翻譯4個(gè)基因序列為氨基酸序列，用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)，用ProtScale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預(yù)測(cè)蛋白疏/親水性。使用GOR IV軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MOLD（http://www.swissmodel.expasy.org/interac）在線預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié) 構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山高山馬鈴薯RNA提取

懷玉山高山馬鈴薯試管苗總RNA的電泳圖見(jiàn)圖1。RNA條帶清晰，無(wú)色素、蛋白、糖類(lèi)等雜質(zhì)污染，28/23S亮度大于18/16S，濃度為602.00 ng·μL?1，總量為18.06 μg，RIN值=8.4，OD260/280=2.17，OD260/230=2.22，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可以進(jìn) 行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因cDNA序列

通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)（圖2），懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因cDNA總長(zhǎng)度為2 418 bp（圖3），G+C 含量為45.08%。

2.3 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白氨基酸序列

圖 1 懷玉山高山馬鈴薯總RNA的電泳Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from Alpine potato of Huaiyushan

圖 2 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of SuSy gene in Alpine potato of Huaiyushan

Protparam預(yù)測(cè)顯示懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白氨基酸序列見(jiàn)圖4。懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白由805個(gè)氨基酸組成，分子量92 471.33 Da，等電點(diǎn)5.87，為親水性蛋白。Leu、Glu、Val、Ala、Lys、Ile、Gly和Arg是懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶SuSy氨基酸序列中含量最為豐富的氨基酸，其平均含量分別為11.1%、9.3%、6.6%、7.0%、6.3%、6.0%、5.7%和5.5%，不含Pyl和Sec（表1）。帶負(fù)電殘基總數(shù)（Asp+Glu）為114，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為95。估計(jì)半衰期為30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外），＞20 h（酵母，體內(nèi)），＞10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）。哺乳動(dòng)物與酵母、大腸桿菌酶的半衰期差異較大，主要受氨基末端氨基酸殘基（如Met、Ala、Glu等）影響。懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白失穩(wěn)指數(shù)（II）計(jì)算為33.96，組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、賴(lài)氨酸（Lys）5種氨基酸殘基構(gòu)成酶的活性中心，與酶的穩(wěn)定性相關(guān)，表明懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白分類(lèi)為穩(wěn)定的。

圖 3 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因堿基組成Fig. 3 Base composition of SuSy gene in Alpine potato of Huaiyushan

圖 4 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白氨基酸序列Fig. 4 Amino acid sequence of SuSy in Alpine potato of Huaiyushan

表 1 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白各氨基酸的數(shù)目和比例Table 1 Number and proportion of amino acids of SuSy in Alpine potato of Huaiyushan

2.4 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白親疏水性分析

從圖5可知，高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而低谷（負(fù)值）的區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性結(jié)果分析表明，最大疏水值為2.5左右，在該多肽中說(shuō)明該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰最大值為?3左右，整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

圖 5 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶蛋白親疏水值分布Fig. 5 Distribution of relative and sparse water values of SuSy in Alpine potato of Huaiyushan

2.5 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）預(yù)測(cè)如下：GOR預(yù)測(cè)顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（Alpha helix，Hh，45.84%）、延 伸 鏈（Extended strand，Ee，15.16%）、無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil，Cc，39.01%）構(gòu)成（圖7）。從分布位點(diǎn)上來(lái)看，C端和N端含延伸鏈和α-螺旋，而無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和α -螺旋則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.6 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SWISS-MODEL預(yù)測(cè)顯示懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合 酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)為四聚體（圖8）。

2.7 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶亞細(xì)胞定位

采用Psort在線軟件對(duì)懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：定位于細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量為5，線粒體中的數(shù)量為5，葉綠體中的數(shù)量為4，表明懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶主要存在細(xì)胞 質(zhì)、線粒體和葉綠體中。

2.8 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

從構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（圖9）中可見(jiàn)，懷玉山高山馬鈴薯與Solanum lycopersicum（番茄）、Solanum pennellii（潘那利番茄）、Solanum chilense（智利番茄）、Solanum tuberosum（馬 鈴 薯）、Capsicum annuum（辣椒）、Capsicum baccatum（風(fēng)鈴辣椒）等6種植物在一個(gè)大分支下，這說(shuō)明懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶基因在進(jìn)化上與六者的親緣關(guān)系較近，尤其是與馬鈴薯（Solanum ltuberosum）的進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

圖 6 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 6 Secondary structure of SuSy in Alpine potato of Huaiyushan

圖 7 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)各部分的比例Fig. 7 Proportion of various parts in secondary structure of SuSy in Alpine potato of Huaiyushan

圖 8 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 8 Tertiary structure of SuSy in Alpine potato in Huaiyushan

圖 9 懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 9 Phylogenetic analysis of SuSy in Alpine potato of Huaiyushan

3 討論

蔗糖合酶屬于蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，廣泛存在于植物體內(nèi)，負(fù)責(zé)催化蔗糖和UDP-果糖合成UDPG，也負(fù)責(zé)催化UDPG分解為蔗糖和UDP-果糖的反應(yīng)[20]。蔗糖合酶與蔗糖代謝其他酶（轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合酶等）的不同處在于其可催化可逆反應(yīng)，不需耗能且不需其他酶參與，直接參與植物體內(nèi)的生物合成及利用[21]。

植物由于長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境得到不斷進(jìn)化，但執(zhí)行一定生理功能的基因會(huì)顯得相對(duì)保守，因此，利用氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化分析可確定物種之間的親緣關(guān)系，還以此來(lái)評(píng)估蛋白功能的相關(guān)性[22]。本研究對(duì)懷玉山高山馬鈴薯（S. tuberosum L. cv.Huaiyushan）蔗糖合酶進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，表明懷玉山高山馬鈴薯（S. tuberosum L. cv. Huaiyushan）與番茄（Solanum lycopersicum）、潘那利番茄（Solanum pennellii）、智利番茄（Solanum chilense）、馬鈴薯（Solanum ltuberosum）、辣椒（Capsicum annuum）、風(fēng)鈴辣椒（Capsicum baccatum）等6種植物在一個(gè)大分支下，這說(shuō)明該基因在進(jìn)化上與這六者的親緣關(guān)系較近，尤其是與馬鈴薯（Solanum ltuberosum）的進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

蔗糖合酶（SuSy）是蔗糖分解的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是衡量庫(kù)強(qiáng)的生化指標(biāo)，特別是在作物品種中。通過(guò)在棉花中表達(dá)馬鈴薯Sus基因，發(fā)現(xiàn)在Sus高表達(dá)系的幼葉中，果糖含量顯著增加，而在伸長(zhǎng)纖維中，果糖和葡萄糖含量均增加[23]。在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中，蔗糖合成酶（Susy）的表達(dá)通過(guò)引入一個(gè)包含Susy編碼區(qū)的嵌合基因而改變，Susy活性和淀粉含量增加[24]。隨著對(duì)馬鈴薯蔗糖合酶的深入研究，馬鈴薯蔗糖合酶以不同亞型形式存在，這些亞型至少由兩個(gè)基因編碼，甚至更多，至今已在45種植物中發(fā)現(xiàn)超過(guò)80個(gè)Sus基因[25]。馬鈴薯蔗糖合成酶基因Sus4-16的5′側(cè)翼序列、先導(dǎo)內(nèi)含子和3′序列的3.6 kb和0.7 kb足以在發(fā)育中的塊莖、腋芽和芽的基部組織、分生組織和根冠中誘導(dǎo)高水平表達(dá)，并賦予葉片蔗糖誘導(dǎo)能力[26]。在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)了兩類(lèi)不同的蔗糖合成酶基因Sus3和Sus4。根據(jù)序列同源性，它們似乎是在雙子葉植物主要科分化之后、番茄和馬鈴薯分化之前進(jìn)化而來(lái)的[21]。這個(gè)觀點(diǎn)與本試驗(yàn)結(jié)果一致。也有研究表明，馬鈴薯蔗糖合酶與玉米蔗糖合酶cDNA序列相比，核苷酸序列的同源性約為70%，推導(dǎo)的氨基酸序列約為75%，3個(gè)氨基酸區(qū)的同源性約為90%[27]。蔗糖合酶通常以二聚體和四聚體的形式存在[28]，但四聚體形式存在的蔗糖合酶是有活性的存在形式[29]。研究表明，馬鈴薯蔗糖合酶的N端的細(xì)胞靶向結(jié)構(gòu)域（cellular targeting domain，CTD）結(jié)構(gòu)域可以使酶與細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白纖維、線粒體及液泡膜等相結(jié)合，參與細(xì)胞靶向的調(diào)控[30]。利用原位雜交技術(shù)研究馬鈴薯淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖合酶基因在塊莖中表達(dá)，但在塊莖形成的頂端分生組織或匍匐莖中不表達(dá)，編碼顆粒結(jié)合淀粉合成酶和淀粉分支酶的mRNAs主要在淀粉質(zhì)體周?chē)e累，而編碼蔗糖合成酶的mRNAs沒(méi)有顯示出優(yōu)先分布[31]。本研究采用Psort在線軟件對(duì)懷玉山高山馬鈴薯（S. tuberosum L. cv.Huaiyushan）蔗糖合酶的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明懷玉山高山馬鈴薯（S. tuberosum L. cv. Huaiyushan）蔗糖合酶主要存在細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中，并沒(méi)有優(yōu)先分布在某個(gè)部位。

4 結(jié)論

懷玉山高山馬鈴薯蔗糖合酶具有典型蔗糖合酶的結(jié)構(gòu)特征，其氨基酸序列和核酸序列與同源物種相似度高，在進(jìn)化上高度保守。