梁建斌 張旭輝 閆治斌 李世風(fēng) 支海林 梁歌恒 李麗仙 李 悅 王 倩 夏瑞英 柴君臣

（甘肅省敦煌種業(yè)集團(tuán)股份有限公司研究院，酒泉 735000）

玉米作為中國(guó)第一大糧食作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)及國(guó)家糧食安全中發(fā)揮著重要的作用。隨著生產(chǎn)需求的不斷增長(zhǎng)，玉米育種者不斷探索和改進(jìn)現(xiàn)代育種技術(shù)。玉米雙單倍體（DH，Doubled haploid）技術(shù)是生物技術(shù)與常規(guī)育種方法結(jié)合產(chǎn)生的一條新的育種途徑，作為快速獲得純系的手段，可以顯著縮短育種年限，加快育種進(jìn)程[1]。種質(zhì)狹窄是影響玉米產(chǎn)量提高的主要原因，也是導(dǎo)致我國(guó)育種進(jìn)程、育種水平與發(fā)達(dá)國(guó)家差距較大的主要原因。外來(lái)種質(zhì)是玉米育種重要的種質(zhì)基礎(chǔ)，單倍體育種對(duì)外來(lái)種質(zhì)進(jìn)行遺傳改良具有重要意義。單倍體育種是目前各大種業(yè)公司廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代育種技術(shù)，已成為現(xiàn)代玉米育種的關(guān)鍵核心技術(shù)之一[2]。

誘導(dǎo)系誘導(dǎo)獲得單倍體，是指利用誘導(dǎo)率較高的誘導(dǎo)系作父本、改良基礎(chǔ)群體材料作母本，誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，是目前應(yīng)用最多的實(shí)用技術(shù)[3]。其中選擇誘導(dǎo)系與基礎(chǔ)材料雜交，單倍體誘導(dǎo)系是一個(gè)關(guān)鍵因素，1959 年Coe[4]發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)單倍體誘導(dǎo)系Stock6，誘導(dǎo)率僅為2%左右，誘導(dǎo)率低嚴(yán)重制約了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。前人研究表明，不同的誘導(dǎo)系對(duì)不同的基礎(chǔ)材料誘導(dǎo)時(shí)誘導(dǎo)率差異較大[5]，選擇誘導(dǎo)率高且穩(wěn)定的誘導(dǎo)系及更適應(yīng)誘導(dǎo)的具有優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)材料至關(guān)重要，我國(guó)玉米單倍體育種總體上還處于引進(jìn)熟化創(chuàng)新階段，與發(fā)達(dá)國(guó)家比較還有相當(dāng)大的差距。到目前為止單倍體誘導(dǎo)系的研究在國(guó)內(nèi)外學(xué)者的共同努力下已經(jīng)有了重大進(jìn)步，已經(jīng)選育出非常有價(jià)值的高油性誘導(dǎo)系列CAUHOI、農(nóng)大高誘號(hào)系列、吉高誘系3 號(hào)和單倍體誘導(dǎo)系H01～H05、WS14、Zarodyshevy Marker Saratovsky、Korichnevv Marker Saratovsky、Moldovian Haploid Inducer 等[6-13]。目前國(guó)內(nèi)誘導(dǎo)系的遺傳背景普遍較為單一，所以不僅要組配更具有雜種優(yōu)勢(shì)的雜交誘導(dǎo)系，還需要拓寬國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源的遺傳背景。前人已有廣泛的研究來(lái)提高單倍體誘導(dǎo)率和單倍體誘導(dǎo)系的農(nóng)藝性狀，除了提高誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率外，研究誘導(dǎo)材料對(duì)單倍體誘導(dǎo)系的影響也很重要[14]。本研究用不同的誘導(dǎo)系誘導(dǎo)不同的基礎(chǔ)群體材料，分析誘導(dǎo)率和雜株率差異，探討誘導(dǎo)系的選用策略，篩選標(biāo)記明顯、誘導(dǎo)率穩(wěn)定且高、雜株率少的誘導(dǎo)系和基礎(chǔ)群體材料。本研究結(jié)果可充實(shí)單倍體的規(guī)模化生產(chǎn)和提高育種效率相關(guān)的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試的4 個(gè)單倍體誘導(dǎo)系材料（表1）均具有籽粒Navajo 標(biāo)記，均引自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家玉米改良中心。供試的12 個(gè)基礎(chǔ)材料類型見(jiàn)表2。

表1 供試單倍體誘導(dǎo)系材料

表2 供試基礎(chǔ)材料類型

通過(guò)雜交誘導(dǎo)所得籽粒主要有以下3 種類型（圖1）。擬單倍體籽粒：籽粒胚乳上有紫色，胚部無(wú)色；雜合二倍體籽粒：籽粒胚部和胚乳上均有紫色；雜合二倍體黃粒：籽粒胚乳黃色，胚部無(wú)色。

圖1 雜交誘導(dǎo)籽粒類型

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)于2020 年冬天在甘肅省敦煌種業(yè)海南玉米育種基地進(jìn)行。為了保證誘導(dǎo)系與基礎(chǔ)群體材料的花期能夠相遇，先播種全部基礎(chǔ)群體材料與第1 期誘導(dǎo)系，第2 期、第3 期誘導(dǎo)系分別間隔5d、10d 播種。花期采用人工去雄并套袋授粉的方式，分別取4 個(gè)誘導(dǎo)系（高誘3 號(hào)、高誘5 號(hào)、紫色5 號(hào)和CS3）的花粉授予12 個(gè)基礎(chǔ)群體材料。收獲后依據(jù)籽粒的Navajo 標(biāo)記進(jìn)行籽粒挑選，胚乳上有誘導(dǎo)標(biāo)記、胚部無(wú)誘導(dǎo)標(biāo)記的籽粒被認(rèn)定為擬單倍體籽粒，并統(tǒng)計(jì)擬單倍體籽粒、有誘導(dǎo)標(biāo)記的二倍體籽粒數(shù)量。2021 年在敦煌種業(yè)西北育種基地（酒泉）對(duì)擬單倍體籽粒進(jìn)行催芽、加倍和田間單株移栽。待植株散粉前對(duì)植株進(jìn)一步鑒定，植株高大粗壯或帶紫色標(biāo)記的為二倍體植株，植株矮小，葉片短小、皺縮、上沖的為單倍體植株，并統(tǒng)計(jì)單倍體植株數(shù)。

1.3 項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)總粒數(shù)、擬單倍體籽粒數(shù)和田間鑒定單倍體株數(shù)，按以下公式計(jì)算誘導(dǎo)率和雜株率，雜株包含非單倍體和發(fā)育不正常的籽粒。

誘導(dǎo)率（%）=田間鑒定單倍體株數(shù)/總粒數(shù)×100

雜株率（%）=（擬單倍體籽粒數(shù)-田間鑒定單倍體株數(shù)）/擬單倍體籽粒數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率和雜株率統(tǒng)計(jì)如表3 所示，本研究中雜交誘導(dǎo)后籽粒的數(shù)量較大，總共有845354 粒，各基礎(chǔ)材料都在5269～52060 粒之間，平均17612 粒，統(tǒng)計(jì)所得誘導(dǎo)率和雜株率具有代表性。

表3 不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率和雜株率統(tǒng)計(jì)

2.2 不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)不同基礎(chǔ)群體材料的誘導(dǎo)率由表4 可知，4 個(gè)誘導(dǎo)系作父本與12 個(gè)基礎(chǔ)材料雜交誘導(dǎo)后，不同基礎(chǔ)群體材料之間的誘導(dǎo)率存在差異，基礎(chǔ)材料D3 和D4 平均誘導(dǎo)率較高，分別為7.44%和7.45%，其中高誘5 號(hào)對(duì)D3 和D4 基礎(chǔ)群體的誘導(dǎo)率分別達(dá)11.36%和11.60%?；A(chǔ)群體D1、D2 和HN3 的平均誘導(dǎo)率較低，分別為1.11%、0.87%和1.85%。4 種誘導(dǎo)系對(duì)HB4 基礎(chǔ)群體的誘導(dǎo)率差異較大，變異系數(shù)達(dá)112.03%，其中CS3 對(duì)HB4 基礎(chǔ)群體的誘導(dǎo)率達(dá)11.90%。

表4 不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)不同基礎(chǔ)群體誘導(dǎo)率分析

同一誘導(dǎo)系誘導(dǎo)不同的基礎(chǔ)材料后平均誘導(dǎo)率大小依次為CS3>高誘5號(hào)>高誘3號(hào)>紫色5號(hào)，分別為5.66%、4.47%、3.17%和3.00%；高誘3 號(hào)和CS3 分別對(duì)12 個(gè)基礎(chǔ)材料的平均誘導(dǎo)率差異相對(duì)較小，高誘5 號(hào)對(duì)12 個(gè)基礎(chǔ)材料的平均誘導(dǎo)率差異較大，變異系數(shù)達(dá)81.00%。

2.3 不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)不同基礎(chǔ)群體材料的雜株率

如表5 所示，不同誘導(dǎo)系和不同基礎(chǔ)材料雜交誘導(dǎo)的雜株率差異較大。不同基礎(chǔ)群體材料之間，D2基礎(chǔ)群體平均雜株率最大，達(dá)46.28%；HB4 基礎(chǔ)群體最小，為10.93%；HN1 的變異系數(shù)最大，說(shuō)明1種誘導(dǎo)系誘導(dǎo)HN1 時(shí)雜株率差異較大，其中CS3 誘導(dǎo)HN1 基礎(chǔ)群體時(shí)的雜株率為8.62%，而高誘3 號(hào)誘導(dǎo)HN1 基礎(chǔ)群體時(shí)的雜株率為70.93%；D2 的變異系數(shù)最小，說(shuō)明4 種誘導(dǎo)系誘導(dǎo)D2 基礎(chǔ)群體時(shí)雜株率差異較小。同一誘導(dǎo)系對(duì)不同基礎(chǔ)材料誘導(dǎo)時(shí)平均雜株率大小依次為高誘3 號(hào)>紫色5 號(hào)>高誘5 號(hào)>CS3，其雜株率分別為39.61%、30.46%、18.11%和16.96%，其中CS3 誘導(dǎo)HB4 時(shí)雜株率僅為0.81%。

表5 不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)不同基礎(chǔ)群體雜株率分析

3 討論與結(jié)論

誘導(dǎo)系的選擇首先注重于提高誘導(dǎo)率，從而產(chǎn)生大量單倍體，提高配子體選擇效率，篩選聚集更多有利基因的目標(biāo)植株。目前，基于Navajo 標(biāo)記的單倍體籽粒篩選主要依靠人工目測(cè)，遺傳標(biāo)記在不同種質(zhì)資源中的表達(dá)水平差異很大，影響誘導(dǎo)系的利用效率和育種成本。因此，選擇和誘導(dǎo)在注重提高誘導(dǎo)率的同時(shí)，還需要加大篩選標(biāo)記表達(dá)的力度。

不同群體材料之間的誘導(dǎo)率存在差異，研究誘導(dǎo)率高的誘導(dǎo)材料對(duì)提高誘導(dǎo)效率具有重要意義[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，同一基礎(chǔ)材料與不同的誘導(dǎo)系進(jìn)行雜交誘導(dǎo)后所得到的單倍體誘導(dǎo)率存在顯著差異，12 份基礎(chǔ)材料誘導(dǎo)后，D3 和D4 的平均誘導(dǎo)率顯著高于其他基礎(chǔ)材料，雜株率也較低；D3 和D4材料與誘導(dǎo)系高誘5 號(hào)進(jìn)行組合后其誘導(dǎo)率分別達(dá)到11.36%和11.60%，這一最佳組合顯著提高了其誘導(dǎo)率，其可能原因是D3 和D4 的遺傳基礎(chǔ)更為復(fù)雜，優(yōu)良的血緣使得其適應(yīng)性更強(qiáng)、育性恢復(fù)能力強(qiáng)，使得誘導(dǎo)率偏高，但具體原因還需進(jìn)一步研究，以期將此材料廣泛應(yīng)用于單倍體誘導(dǎo)的基礎(chǔ)材料來(lái)滿足商業(yè)育種的需求。不同誘導(dǎo)系對(duì)同一基礎(chǔ)材料進(jìn)行雜交誘導(dǎo)所得單倍體誘導(dǎo)率存在顯著的差異，本研究發(fā)現(xiàn)4 個(gè)誘導(dǎo)系單倍體平均誘導(dǎo)率在3.00%～5.66%之間，這一研究結(jié)果與李高科等[16]研究結(jié)果相一致。其中CS3 的誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，變異系數(shù)也小于高誘5 號(hào)和紫色5 號(hào)，說(shuō)明其誘導(dǎo)系的穩(wěn)定性較高，平均雜株率也低于其他誘導(dǎo)系，表明在玉米單倍體誘導(dǎo)育種中，可繼續(xù)加大對(duì)CS3 的利用。本研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)材料和誘導(dǎo)系都會(huì)對(duì)玉米單倍體誘導(dǎo)率和雜株率產(chǎn)生一定影響，因此誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)能力不僅受自身遺傳背景的影響，也受其誘導(dǎo)的基礎(chǔ)材料遺傳背景的影響，但由于本研究所用的基礎(chǔ)材料有限，還需進(jìn)一步針對(duì)玉米單倍體進(jìn)行專用型誘導(dǎo)系的選育以及基礎(chǔ)材料的篩選，這是本課題組下一階段的研究重點(diǎn)。

目前，雖然單倍體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于商業(yè)化育種，但仍有以下4 個(gè)方面有待改進(jìn)。首先，應(yīng)選擇具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的高頻單倍體誘導(dǎo)系。其次，在新的誘導(dǎo)系中整合多個(gè)有效標(biāo)記，提高單倍體鑒定的有效性和準(zhǔn)確性。第三，結(jié)合倍率相關(guān)的QTL 定位和基因編輯技術(shù)，建立高效的倍增體系。最后，利用組織培養(yǎng)和選擇標(biāo)記縮短DH 系生產(chǎn)所需的時(shí)間。今后，解決上述方面的技術(shù)難題，將促進(jìn)單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在現(xiàn)代玉米育種中得到更廣泛的應(yīng)用。