林裕勝，江錦秀，張靖鵬，游 偉，胡奇林

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

0 前言

【研究意義】星狀病毒是重要的傳染病原之一，對人類健康和動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)已構(gòu)成威脅，特別是給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。開展罹病雛鵝新型鵝星狀病毒的分離鑒定，可為新型鵝星狀病毒的致病機(jī)制研究和疫苗研發(fā)積累素材、提供理論參考。【前人研究進(jìn)展】星狀病毒（Astroviruses,AstV）分為哺乳動(dòng)物星狀病毒屬（Mamastrovirus）和禽星狀病毒屬（Avastrovirus），已被證實(shí)的哺乳動(dòng)物星狀病毒屬有19種，禽星狀病毒屬有3種[1?3]。其中禽星狀病毒1型主要為火雞星狀病毒1型（Turkey astrovirus 1, TAstV-1）；禽星狀病毒2型包括禽腎炎病毒1型（Avian nephritis virus 1, ANV-1）和腎炎病毒 2型 （Avian nephritis virus 2 ANV-2）； 禽星狀病毒3型包括鴨星狀病毒1型（Duck astrovirus 1, DAstV）、火雞星狀病毒2型（Turkey astrovirus,TAstV-2）和一些未經(jīng)分類的星狀病毒[3]。星狀病毒基因組的高度變異使其對環(huán)境和宿主具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，甚至可跨種傳播[4?5]。2017年以來，國內(nèi)多省市爆發(fā)了一種以痛風(fēng)為主要特征的致死性傳染病，5～20日齡雛鵝感染后精神沉郁、食欲減退、消瘦、四肢癱瘓等，死亡率高達(dá)30%，剖檢可見患病鵝內(nèi)臟、翅腿部關(guān)節(jié)及喙部等處出現(xiàn)白色尿酸鹽沉積；經(jīng)病原分離鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)以及序列分析，確定為新型鵝星狀病毒（Novel goose astrovirus，GAstV）[6?9]。【本研究切入點(diǎn)】2019年8月，福建省南平市某鵝場雛鵝大量出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，剖檢有尿酸鹽沉積的傳染性疾病，在5～20日齡的雛鵝中發(fā)病率高達(dá)40%，死亡率為80%，然而引起該病的病原尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為明確其病因，本研究通過采集患病雛鵝的心、肝、脾、肺、腎等組織進(jìn)行PCR檢測和病原分離鑒定，最終確定引起該場發(fā)病的病原為新型鵝星狀病毒，對分離的新型鵝星狀病毒的ORF2部分基因進(jìn)行克隆測序分析，明確其遺傳進(jìn)化規(guī)律，為后續(xù)疫苗研制和開展相關(guān)基礎(chǔ)研究提供重要素材。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

3份心肝脾肺腎組織樣品均采自福建省南平市某發(fā)病鵝場，患病鵝臨床癥狀為關(guān)節(jié)腫大，精神沉郁，剖檢可見肝臟、肺臟、腎臟及關(guān)節(jié)腔有嚴(yán)重的尿酸鹽沉積。

1.2 試驗(yàn)材料與主要試劑

健康鵝胚由福建長樂灰鵝保種場提供，該場種鵝所產(chǎn)種蛋、孵出的雛鵝未發(fā)生過痛風(fēng)病，鵝星狀病毒PCR檢測結(jié)果為陰性，鵝星狀病毒抗體檢測結(jié)果為陰性；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、病毒DNA/RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；pMD19-T載體、DL2000均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 樣品處理

無菌采集患病雛鵝心、肝、肺、腎、脾等組織并進(jìn)行細(xì)菌分離，同時(shí)對采集的肝臟、脾臟和腎臟等組織，在生物安全柜內(nèi)用滅菌剪刀剪碎后按照1∶10加 入 無 菌PBS（pH7.4、0.01 mol·L?1）進(jìn) 行 研磨，反復(fù)凍融3次后，3 000 r·min?1離心15 min，上清液0.22 μm濾器過濾后?20 ℃冰箱保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已公布的新型鵝星狀病毒ORF2基因（No: MN399857.1）序列，Oligo 7.9軟件設(shè)計(jì)1對新型鵝星狀病毒特異性檢測引物，引物序列：P1: 5′- AT TACCCATGAAGGCCGAGAGGAAGCTTGAGAAA-3′/P2：5′- GTTCAAGATGCGGCCGAGCTTTTATG GTATCTAT-3′，退火溫度55 ℃，擴(kuò)增片段為383 bp。鵝細(xì)小病毒（Goose parovovirus, GPV）、禽流感病毒（Avian influence virus, AIV）、禽呼腸孤病毒（Avian orthoreovirus, ARV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鵝多瘤病毒（Goose polyoma virus, GPoV）及鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus, GoCV）等鵝常見病毒檢測的引物序列參照參考文獻(xiàn)[10]（表1），所有引物均由福州擎科生物工程有限公司合成。

1.5 病原分離

取過濾后的上清液，經(jīng)尿囊膜接種11日齡鵝胚，37 ℃孵育，每天早晚各照胚1次，棄掉24 h內(nèi)死亡鵝胚，連續(xù)觀察7 d，并做好記錄，收集尿囊液和病變明顯的組織臟器。收獲的組織和尿囊液經(jīng)研磨處理后繼續(xù)接種鵝胚，連續(xù)盲傳5次，取3～5代次尿囊液及組織臟器研磨液進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.6 核酸的提取

利用全式金DNARNA試劑盒，按照說明書操作步驟提取組織樣品和研磨液中的DNA和RNA。

1.7 反轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用北京全式金生物技術(shù)有限公司商品化反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的樣本總 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL）：Random Primer 1 μL，RNase-freewater 5.0 μL，TranScript RT/RI Enzyme Mix 1.0 μL，gDNA Remover 1.0 μL，Reaction Mix 10 μL，RNA模板2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，4 ℃終止。

表 1 鵝常見病毒引物Table 1 Primers for common goose viruses

1.8 PCR擴(kuò)增

以上述cDNA和DNA為模板，用合成的新型鵝星狀病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝圓環(huán)病毒及鵝多瘤病毒等引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測[10]。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Mix 10 μL，上 游 引 物1.0 μL，下 游 引 物1.0 μL，DNA/cDNA模板2 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性 30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

1.9 新型鵝星狀病毒ORF2基因克隆、測序與分析

將設(shè)計(jì)好ORF2基因引物對1.5中研磨液提取的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照1.8中進(jìn)行，退火溫度為55 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化試劑盒純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性克隆后，送至福州尚亞生物科技有限公司測序。利用DNAStar.Lasergene.v7.1軟件對測定的ORF2基因序列與GenBank上公布的32株新型鵝星狀病毒株（表2）進(jìn)行相似性對比分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品RT-PCR檢測結(jié)果

除設(shè)計(jì)的新型鵝星狀病毒特異性引物對3份組織研磨液在380 bp左右處有擴(kuò)增條帶外，其余鵝常見病毒病均未擴(kuò)增，圖1中僅展現(xiàn)新型鵝星狀病毒引物擴(kuò)增片段。

2.2 病原分離

為進(jìn)一步明確是否有細(xì)菌感染，對患病雛鵝心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果均未分離到細(xì)菌，排除是由細(xì)菌感染引起的。組織研磨液處理后接種11日齡鵝胚后，7日內(nèi)鵝胚均未出現(xiàn)死亡。第1代至第5代鵝胚均出現(xiàn)全身廣泛性出血點(diǎn)和出現(xiàn)斑，剖檢胚體可見肝臟出血點(diǎn)，第3代后鵝胚出現(xiàn)尿囊膜增厚，解剖胚體可見肝臟組織壞死（圖2）。取鵝胚第3代到第5代尿囊液和組織研磨液進(jìn)行鵝常見病毒PCR和RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僅有新型鵝星狀病毒在380 bp處有特異性的擴(kuò)增條帶，其他病原未有擴(kuò)增條帶（圖3）。表明分離的毒株為新型鵝星狀病毒。

2.3 鵝星狀病毒ORF2基因序列分析

測序結(jié)果經(jīng)NCBI在線比對分析后，與新型鵝星狀病毒的同源性最高，表明分離株為新型鵝星狀病毒：命名為 FJ-NP 株。將FJ-NP 株ORF2基因擴(kuò)增序列與下載的32株新型鵝星狀病毒進(jìn)行相似性分析和遺傳進(jìn)化分析，相似性結(jié)果顯示FJ-NP株 ORF2基因核苷酸序列與32株參考株的相似性為97.69%～99.74%，其中與黑龍江AstV-Goose-2018-HLJ01和河南（AstVHN02-Goose-1119-18、AstV-AH02-Goose-0715-18、AstVHB02-Goose-0310-19）相似性最高均為99.74%，與北京HN1G株相似性最低為97.4%；遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示分離株與安徽（GD AHAU2、AHAU3、AHAU5）株、黑龍江AstV-Goose-2018-HLJ01株和河南（AstVHN02-Goose-1119-18、AstV-AH02-Goose-0715-18、AstVHB02-Goose-0310-19、AstV-HN03-Goose-0402-19）株在同一進(jìn)化分支上，與湖北AstV-HBXG-Goose-2019株、北京HN1G株、福建GTF-04株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，暗示該流行毒株可能為安徽和河南的變異株（圖4～6）。

表 2 新型鵝星狀病毒參考毒株Table 2 Reference strains for novel goose astrovirus

圖 1 臨床樣品中新型鵝星狀病毒RT-PCR檢測Fig. 1 RT-PCR detection of novel goose astrovirus in clinical samples

圖 2 死亡鵝胚體變化Fig. 2 Pathologic changes in goose embryo

圖 3 分離株新型鵝星狀病毒RT-PCR檢測結(jié)果Fig. 3 RT-PCR result on isolated strain of novel goose astrovirus

圖 4 FJ-NP 株ORF2基因PCR擴(kuò)增圖Fig. 4 RT-PCR amplification of FJ-NP ORF2 genes

圖 5 ORF2部分基因核苷酸同源性比較Fig. 5 Homology of partial ORF2 gene nucleotide

圖 6 ORF2部分基因遺傳進(jìn)化分析Fig. 6 Phylogenetic tree analysis based on partial ORF2 gene

3 討論與結(jié)論

星狀病毒可引起雛鴨腸炎、腹瀉、病毒性肝炎，雞的腸炎，以及降低各種禽類孵化率等，但在鵝群中的感染報(bào)道近幾年才有。Zhang等[6]于2015年在江蘇、安徽、廣東、山東和福建等地采集病料中檢測到星狀病毒，通過病原分離鑒定以及全基因測序證實(shí)分離到的星狀病毒與禽類和人的星狀病毒存在一定差異，結(jié)合其剖檢癥狀以內(nèi)臟和關(guān)節(jié)腔尿酸鹽沉積為主，有別于傳統(tǒng)星狀病毒剖檢特征，故命名為新型鵝星狀病毒。

南平市是福建省養(yǎng)鵝主要地區(qū)，近年來多有關(guān)于新型鵝星狀病毒在該地區(qū)發(fā)生的報(bào)道，已成為制約養(yǎng)鵝業(yè)的主要疫病之一。2019年南平市某養(yǎng)鵝場大量雛鵝出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，剖檢內(nèi)臟和關(guān)節(jié)有大量的尿酸鹽沉積，疑似感染了新型鵝星狀病毒。本團(tuán)隊(duì)通過實(shí)地調(diào)研、臨床癥狀和剖檢病變初步判斷該養(yǎng)鵝場感染了新型鵝星狀病毒感染。通過對采集樣品進(jìn)行病原分離、RT-PCR檢測和克隆測序分析，最終成功分離到了1株新型鵝星狀病毒，命名為FJ-NP。國內(nèi)外的研究結(jié)果顯示引起鵝痛風(fēng)的原因較多，比如高鈣高蛋白飼料引發(fā)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝障礙和腎臟損傷，缺水導(dǎo)致的尿酸血癥，以及磺胺類藥物引起的中毒和腎臟損傷等，因此在臨床診斷過程中應(yīng)當(dāng)注意鑒別診斷[11?13]。目前新型鵝星狀病毒的起源、宿主范圍，變異程度，分子發(fā)病機(jī)制和潛在的人畜共患風(fēng)險(xiǎn)等情況仍不清，有待于進(jìn)一步研究。根據(jù)ORF2基因編碼的衣殼蛋白序列，禽星狀病毒可分為3型即禽星狀病毒1、2和3型[14?17]。本研究通過PCR擴(kuò)增獲得了分離株ORF2基因部分序列，隨后進(jìn)行克隆測序，對測序結(jié)果開展遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示該分離株ORF2核苷酸序列與GenBank上發(fā)表的32株新型鵝星狀病毒的同源性均在97%以上，且與黑龍江AstV-Goose-2018-HLJ01和河南（AstVHN02-Goose-1119-18、AstV-AH02-Goose-0715-18、AstVHB02-Goose-0310-19）相似性最高均為99.74%，遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示與安徽（GD AHAU2、AHAU3、AHAU5）株、黑龍江AstV-Goose-2018-HLJ01株和河南（AstV-HN02-Goose-1119-18、AstV-AH02-Goose-0715-18、AstV-HB02-Goose-0310-19、AstV-HN03-Goose-0402-19）株在同一進(jìn)化分支上，與2014年北京HN1G株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明當(dāng)前流行的新型鵝星狀病毒已發(fā)生變異。

鑒于該病為新發(fā)病，目前對該病的流行病學(xué)及致病機(jī)制等研究尚未深入，同時(shí)疫苗研制仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚未有商品化疫苗可進(jìn)行預(yù)防。因此，加快疫苗研制和致病機(jī)制的研究對于該病的科學(xué)防控具有重要的作用。本研究為我省在新型鵝星狀病毒相關(guān)工作積累了研究素材，并提供了理論依據(jù)。