姚興梅，郭丹，姚帥

（1.安陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，河南安陽 455000）（2.河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院，河南鄭州 450046）

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，致死率一直居高不下。到目前為止，我國患肝癌去世的患者約占世界肝癌患者的 10%，嚴(yán)重威脅我國國民健康水平[1,2]。隨著醫(yī)療水平的提高，肝癌的治療水平和預(yù)后也在逐步攀升，肝癌早期診斷準(zhǔn)確率、腫瘤切除率和生存率都有明顯提高。但由于肝癌初期臨床表征不明顯，往往確認(rèn)時已經(jīng)是中晚期，此時癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移迅速，使得肝癌患者的生存率大幅度降低。

21世紀(jì)以來，分子生物學(xué)迅速發(fā)展，為肝癌治療提供充分的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相關(guān)研究結(jié)果表明，利用HBV中的X蛋白可以對肝癌起到抑制作用，激活肝細(xì)胞中的Bel敏感性，能夠提高治療效果[3-5]。而對人體內(nèi)X基因的研究發(fā)現(xiàn)，X基因能夠使肝組織的病理性發(fā)生轉(zhuǎn)變，說明其具有分解肝癌細(xì)胞的作用，需要在今后的研究中進(jìn)行深入探討[6]。

硒是生命活動所必需的微量元素之一。隨著對硒化合物生理作用研究的不斷深入，其抗癌作用越來越受到廣泛的重視。數(shù)十年前，有學(xué)者通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)硒具有抗癌作用，隨后大量的人體實(shí)驗(yàn)充分證明硒是人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，且具有癌癥預(yù)防機(jī)能。硒使癌細(xì)胞克隆增殖受到抑制，引起細(xì)胞的主動死亡，硒所觸發(fā)的細(xì)胞凋亡與毒性效應(yīng)無關(guān)，既不引起DNA損傷，也不需要抑癌基因P53參與，對人體造成的傷害小，硒誘導(dǎo)細(xì)胞循環(huán)蛋白發(fā)生改變，阻止癌細(xì)胞繼續(xù)分裂，因此證明了硒對癌細(xì)胞具有抑制作用?，F(xiàn)今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有抗癌作用的含硒物質(zhì)有大蒜、高良姜、菊花、靈芝、萊菔子、海參、牡蠣、綠茶等。

到目前為止，硒的研究方向逐漸從總硒轉(zhuǎn)移到有機(jī)硒，因此對于綠茶富硒蛋白的研究已成最大的熱點(diǎn)。在中國，綠茶的種植歷史悠久，古時候茶與瓷器一直是中國的代表性產(chǎn)物。綠茶中具有較多的天然物質(zhì)，在干燥過程中，營養(yǎng)損失流失較小，其中硒蛋白、茶多酚、咖啡堿保留了鮮葉的85%以上，葉綠素保留了50%左右。近些年來，相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者對綠茶成分與功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，綠茶具有明顯的抗氧化作用，可以減緩人體衰老，提高人體免疫力。綠茶富硒蛋白可以破壞合成過程中的癌細(xì)胞DNA，抑制癌細(xì)胞增殖。綠茶富硒蛋白能提高NK細(xì)胞和T細(xì)胞的活性，加快巨噬細(xì)胞的吞噬作用，提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，增加白細(xì)胞數(shù)量，加快免疫球蛋白的生長等，增強(qiáng)患者體質(zhì)，使患者的免疫能力得到提升，有利于抵御癌癥[7,8]。

本文以肝癌HepG2細(xì)胞作為靶向細(xì)胞，研究綠茶富硒蛋白對其的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 原料設(shè)備

富硒綠茶，江蘇省宜興市國宗元富硒茶業(yè)有限公司；人肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞研究所細(xì)胞庫；小牛血清，貝森佳生物制藥；青霉素、鏈霉素，四川長威制藥有限公司；乙酸、硫酸銨、氫氧化鈉，南京化學(xué)試劑股份有限公司；JY98-Ⅲ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，上海新芝生物技術(shù)研究所；Tris-HCI緩沖液、PBS緩沖液，湖北康迪斯化工有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，美侖生物技術(shù)有限公司；明膠干粉，上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），動力精細(xì)化工有限公司；紫外分光光度儀，梅特麗-托利多國際貿(mào)易上海有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-50N型），寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞

以50 mg/L的青霉素、50 mg/L的鏈霉素、9%小牛血清制備 DMEM 培養(yǎng)基；以此培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，將其置于常溫培養(yǎng)箱內(nèi)，備用。

1.2.2 制備綠茶富硒蛋白

對富硒綠茶進(jìn)行干燥處理加，粉碎后過100目篩，在-20 ℃環(huán)境中凍藏備用[9]。在富硒綠茶茶渣中依次加入去離子水、0.05 mol/L Tris-HCI緩沖液（pH 8.0)、0.20 mol/L PBS 緩沖液（pH 8.0)、0.50 mol/L NaCl、0.10 mol/L NaOH，混合均勻，之后進(jìn)行細(xì)胞破壁處理，將混合物攪拌均勻，3000 r/min離心30 min，取上清液，加入硫酸銨至50%飽和以沉淀含硒蛋白，放置在恒溫箱中4 ℃靜置12 h，2000 r/min離心20 min，將沉淀物用提取液溶解，透析24 h，-40 ℃凍干，得到綠茶富硒蛋白。通過上述過程所得綠茶富硒蛋白純度達(dá)90.34%以上，有機(jī)硒含量為0.87 mg/L。

1.2.3 綠茶富硒蛋白對HepG2細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞，使用2.50 g/L的胰酶對其進(jìn)行消化，使其成為單個細(xì)胞，以此配置細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)板內(nèi)每孔接種100 μL，在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培育1 d，清除上清液，加入180 μL DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培育1 d，此時肝癌HepG2細(xì)胞的生長進(jìn)入同步化，將其作為對照組，該組不干預(yù)肝癌HepG2細(xì)胞增殖與凋亡等過程。在此基礎(chǔ)上，把濃度為10 g/L的二甲基亞砜（DMSO）加入到 DMEM 培養(yǎng)基，將其作為參考組，該組利用DMSO誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。在 DMEM 培養(yǎng)基中加入處理過的綠茶硒蛋白，配置綠茶硒蛋白溶液[10,11]，濃度分別為：0.11 g/L、0.18 g/L、0.25 g/L、0.50 g/L，用微孔濾膜過濾除菌[12]。將4個不同濃度綠茶硒蛋白溶液為實(shí)驗(yàn)組，每組個設(shè)置4～5個平行孔，將三組溶液放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1 d、2 d、3 d后每孔加入15 μL的FITC染色劑，重新放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，吸管吸取培養(yǎng)上清液，棄用，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖晃20 min，充分溶解甲臜結(jié)晶，置于酶標(biāo)儀450 nm處，測定光密度值，通過光密度值計算綠茶硒蛋白對肝癌 HepG2細(xì)胞的抑制率，公式為：抑制率/%=（1-實(shí)驗(yàn)組光密度值/對照組光密度值）×100%。

1.2.4 HepG2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取抑制實(shí)驗(yàn)中制備的各組溶液，使用0.25%胰酶采集各組中的細(xì)胞，PBS沖洗兩遍，在 100 μL的binding buffer中重懸，使用FITC染色，采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率[13,14]。

1.2.5 肝癌HepG2細(xì)胞凋亡因子相關(guān)表達(dá)

取抑制實(shí)驗(yàn)中制備的各組溶液，用試劑Trizoldui提取RNA，之后測定RNA純度（A270/A290＞1.5），使用儀器為：紫外分光光度儀，逆轉(zhuǎn)錄合成DNA時運(yùn)用1 μL RNA，凋亡因子P53、Bcl-2、Bax、VEGF的表達(dá)以PCR檢測。PCR反應(yīng)需要一系列條件：置于94 ℃下25 s，將primer5計算得出的TM值作為退火溫度，進(jìn)行25 s退火。在72 ℃的溫度下，進(jìn)行40 s的延伸，循環(huán)30次，置放于72 ℃環(huán)境下4 min。在11 g/L的TAE瓊脂糖凝膠電泳，F(xiàn)ITC染色，需要在凝膠成像分析系統(tǒng)紫外光的條件下進(jìn)行拍照，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行圖像分析，內(nèi)參照為β-actin，基因水平的指標(biāo)是Volume[15,16]。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果，mean±PD表示分析結(jié)果，濃度之間比較使用 LSD法，利用 t-test與One-Way分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

隨著綠茶富硒蛋白濃度的逐漸增加，觀察不同時間段肝癌HepG2細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)抑制率不斷升高，說明時間和濃度是影響抑制效果的關(guān)鍵因素，具有效應(yīng)關(guān)系，見表1。

從表1可以看出，隨著綠茶富硒蛋白濃度與光密度值的增加，綠茶富硒蛋白對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制率呈倍數(shù)上升，濃度越高，對肝癌HepG2e細(xì)胞抑制越強(qiáng)。綠茶富硒蛋白濃度為0.11 g/L，培養(yǎng)1 d的抑制率約為3.82%；當(dāng)濃度升高到0.50 g/L，培養(yǎng)3 d的抑制率約為26.92%，抑制效果最好，對照組的抑制率始終為0。但是從數(shù)據(jù)中可以看出，在培養(yǎng)2 d和3 d時，抑制率上升緩慢，這是因?yàn)橐种聘伟〩epG2細(xì)胞增殖對綠茶富硒蛋白濃度具有依賴性，說明采用綠茶富硒蛋白進(jìn)行HepG2細(xì)胞抑制是一個長期過程。

對照組和實(shí)驗(yàn)組對HepG2細(xì)胞作用2 d后顯微鏡觀察結(jié)果見圖1，從圖中可以看出綠茶富硒蛋白對肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，肝癌HedG細(xì)胞的具體變化見顯微圖像對比。

表1 綠茶富硒蛋白對HepG2細(xì)胞增殖抑制率的影響Table 1 Effect of green tea selenium rich protein on the inhibition rate of HepG2 cell proliferation

表2 肝癌HepG2細(xì)胞周期分析Table 2 HepG2 cell cycle analysis of hepatoma

圖1a中為對照組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)2 d，圖1b中為肝癌HepG2細(xì)胞在0.11 g/L的綠茶富硒蛋白中培養(yǎng)2 d。從圖片可以看出，對照組肝癌HepG2細(xì)胞飽滿有活力，分布均勻，核膜完整，形狀規(guī)律。在綠茶富硒蛋白的作用下，肝癌HepG2細(xì)胞出現(xiàn)衰弱，體積坍縮，細(xì)胞形狀變?yōu)閳A形，細(xì)胞邊緣呈現(xiàn)波紋狀，活性降低，出現(xiàn)凋亡形態(tài)。

圖1 綠茶富硒蛋白對HepG2細(xì)胞抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of green tea selenium rich protein on HepG2 cells

HepG2細(xì)胞經(jīng)不同處理作用24 h后，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，綠茶富硒蛋白可使S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其結(jié)果是促進(jìn)細(xì)胞分化為G0-G1和G2-M期，但隨劑量加大，肝癌HepG2細(xì)胞主要停留于G2-M期。說明在綠茶富硒蛋白可有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞，但是在臨床中要把握好用量。

不同濃度的綠茶富硒蛋白對 HepG2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用見表3。

運(yùn)用細(xì)胞儀檢測不同濃度的綠茶富硒蛋白對肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡率的影響。通過表3可知，對照組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率約為6.17%，而當(dāng)綠茶富硒蛋白濃度為0.50 g/L時，肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率最大值約為 30.60%，參考組肝癌 HepG2細(xì)胞凋亡率約為10.82%，且實(shí)驗(yàn)組的肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率始終高于對照組和參考組，通過對比可知綠茶富硒蛋白具備誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的能力。根據(jù)數(shù)據(jù)可以看出，在綠茶富硒蛋白發(fā)揮作用1 d后，實(shí)驗(yàn)組凋亡率升高，雖然對照組和參考組也出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，但大部分是由于細(xì)胞代謝。綠茶富硒蛋白對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子有一定影響，相關(guān)因子分別為：Bcl-2、Bax、VEGF、P53mRNA等，影響結(jié)果見表4。

表3 不同濃度的綠茶富硒蛋白對HepG2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用Table 3 Induction of apoptosis of HepG2 cells by different concentrations of green tea selenium rich protein

圖2 不同濃度綠茶富硒蛋白對HepG2細(xì)胞凋亡因子表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of different concentration of green tea selenium rich protein on the expression of apoptotic factors in HepG2 cells

表4 不同濃度綠茶富硒蛋白對HepG2細(xì)胞凋亡因子表達(dá)水平的影響Table 4 Effect of different concentration of green tea selenium rich protein on the expression of apoptotic factors in HepG2 cells

為更好地觀察不同濃度綠茶富硒蛋白對 HepG2細(xì)胞凋亡因子表達(dá)水平的影響程度，將表4轉(zhuǎn)換成圖2。肝癌細(xì)胞的擴(kuò)散依賴于細(xì)胞增殖和凋亡的平衡性，如果平衡，癌細(xì)胞將會不斷增殖與擴(kuò)散；如果失衡，就會使細(xì)胞凋亡增加，提升治療效果。根據(jù)以往研究可得，細(xì)胞凋亡因子中p35和Bcl-2是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的決定因素，從功能上看，家族基因蛋白Bcl-2分為促凋亡和抑凋亡兩類，分別為Bax與Bad和Bcl-2與Bcl-xl，從圖2中可以看出，在綠茶富硒蛋白的作用下，肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)水平整體呈下降趨勢，而且綠茶富硒蛋白濃度越高，對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響越大，實(shí)驗(yàn)組中P53/β-actin相較于對照組不具備統(tǒng)計學(xué)意義，Bcl-2和Bax的比值小于 1，通過這些數(shù)據(jù)可以看出綠茶富硒蛋白具有促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用。

3 結(jié)論

從本文實(shí)驗(yàn)可以看出，高濃度的綠茶富硒蛋白對肝癌 HepG2細(xì)胞有顯著抑制作用，但具有一定依賴性，當(dāng)濃度為0.50 g/L綠茶富硒蛋白對肝癌HepG2細(xì)胞作用 3 d時，抑制率高達(dá) 29.92%，凋亡率達(dá)到30.60%，可以有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，此時的肝癌 HepG2細(xì)胞常伴隨出現(xiàn)凋亡小體和核質(zhì)濃集的凋亡形態(tài)學(xué)特性。由于綠茶富硒蛋白在基因水平上沒有對Bax蛋白進(jìn)行調(diào)控，所以其基因水平出現(xiàn)下降。肝癌HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax比值小于1，說明綠茶富硒蛋白具有促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用。