沈晶，舒恒，石孟瓊，張媛媛，朱麗金，雷乾坤，張繼紅，賀海波,4，鄒坤

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北宜昌 443002）（2.三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北宜昌 443002）（3.三峽大學(xué)中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院,湖北宜昌 443001）（4.藥食同源大健康產(chǎn)品開發(fā)利用宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北宜昌 443002）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）被認(rèn)為是非酒精性肝病全世界慢性肝病最常見的病因是一種病理生理學(xué)復(fù)雜的多因素疾病，包括肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎以及隨后的纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。近年來研究顯示，NAFLD的發(fā)病率及檢出率在全球范圍內(nèi)逐年攀升，已成為發(fā)達(dá)國家及地區(qū)，甚至某些發(fā)展中國家最常見的肝病之一。由于NAFLD確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前仍沒有治療NAFLD的特效藥物[2]。

AMP活化蛋白激酶（AMPK）是一個(gè)與肝臟脂質(zhì)正性調(diào)節(jié)相關(guān)的主要細(xì)胞能量代謝開關(guān)，活化的AMPK（p-AMPKα）可減少肝臟甘油三酯的積累，增加脂肪酸氧化和代謝率從而改善NAFLD[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是與機(jī)體代謝狀態(tài)關(guān)系密切的另一代謝調(diào)節(jié)酶，它通過調(diào)節(jié)組蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的乙?；揎椝蕉鴧⑴c調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)代謝酶的活性[4]。Matsusue等人[5]證實(shí)p-AMPK和SIRT1協(xié)同抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)合成受到抑制，從而抑制NAFLD發(fā)生發(fā)展；Chyau等人[6]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1c（SREBP-1c）與 PPARγ關(guān)系密切，是NAFLD脂肪酸代謝發(fā)生異常的核心酶蛋白，上調(diào) p-AMPKα、SIRT1蛋白表達(dá)，下調(diào)SREBP-1c、PPARγ蛋白表達(dá)可有效緩解NAFLD病理進(jìn)程。因此，可以推測(cè)積極調(diào)控AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路可有效減少NAFLD的發(fā)生和發(fā)展危險(xiǎn)。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶和發(fā)酵茶中主要的多酚類兒茶素，約占兒茶素含量的50%～80%[7]。盡管EGCG的生物學(xué)效應(yīng)尚未完全了解，研究表明，EGCG可降低腫瘤在不同器官部位的發(fā)生率和多樣性，并在心血管、神經(jīng)退行性疾病和代謝綜合征（包括肥胖、胰島素抵抗和血脂異常）中發(fā)揮作用[8]。此外，EGCG對(duì)不同類型的肝損傷有許多有益的作用，如免疫性肝損傷[9]，氟化鈉誘導(dǎo)的氧化性肝損傷[10]和慢性酒精性肝損傷[8]。其他研究表明，在 2型糖尿病或NAFLD小鼠中，EGCG通過降低循環(huán)胰島素、改善胰島素敏感性和減輕胰島素抵抗來減輕肝損傷的嚴(yán)重程度[11-13]，但EGCG防治NAFLD具體作用和機(jī)制仍然缺乏。

因此，本研究采用ApoE-/-小鼠配合高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制NAFLD模型，觀察EGCG對(duì)NAFLD干預(yù)的效果，以期為深入EGCG抗NAFLD的機(jī)制研究提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

體質(zhì)量為 20～25 g的雄性 ApoE?/?小鼠（品系C57BL/6J）購置于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，許可證號(hào)為SCXK（蘇）2015-0001；體質(zhì)量為25～30 g的雄性野生型C57BL/6J小鼠購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（鄂）2017-0061。本實(shí)驗(yàn)通過了三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查，并在其指導(dǎo)下進(jìn)行。

谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）、羥脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖（GLU）和尿酸（UA）、胰島素、瘦素和脂聯(lián)素試劑盒，南京建成生物工程研究所；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、AMPKα、SIRT1、脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶1（ACC-1）、SREBP-1c、硬脂酰輔酶 A 去飽和酶-1（SCD-1）、PPARγ、GAPDH引物合成（引物序列見表1）、TRIzol、DEPC、Prime ScriptTMRT reagent Kit、Taq DNA聚合酶，大連Takara公司；p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、FASN、p-ACC-1、ACC-1、p-SREBP-1c、SREBP-1c、SCD-1和PPARγ一抗，美國Cell Signaling Technology公司；β-actin一抗及二抗，武漢博士德生物工程有限公司；蛋白提取及ECL試劑盒，南京碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR

圖1 小鼠NAFLD模型建立及給藥Fig.1 Establishment and administration of NAFLD model in mice

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；渦旋儀，美國奧然科學(xué)技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf股份公司；血漿生化分析儀，日本富士公司；解剖顯微鏡，日本Nikon公司；脫水機(jī)、顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司；超薄切片機(jī)，奧地利Leica公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；核酸測(cè)定儀，美國Thermo公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NAFLD模型的建立及EGCG治療

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只ApoE?/?小鼠每天定量給予高脂飼料喂養(yǎng)，另取 10只野生型C57BL/6J小鼠作為正常組，每天定量給予普通飼料喂養(yǎng)[14]。8周后，喂養(yǎng)高脂飼料的40只ApoE?/?小鼠隨機(jī)分為模型組、奧利司他組、EGCG低劑量組（EGCG-L）、EGCG高劑量組（EGCG-H），每組10只。奧利司他組小鼠按10 mg/kg灌胃給予奧利司他，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1,15,16]并結(jié)合我們的前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果EGCG-L和EGCG-H組分別按20、40 mg/kg灌胃給予EGCG，而正常和模型組則灌胃給予同體積的生理鹽水，每天1次連續(xù)8周，各組的飼料喂養(yǎng)不做改變見圖1。

1.3.2 標(biāo)本收集與處理

各組小鼠在給藥8周后禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉后摘除眼球取血，抗凝后分離血漿，保存于-80 ℃?zhèn)渖笜?biāo)檢測(cè)；取肝臟稱肝臟質(zhì)量，用預(yù)冷生理鹽水漂洗后剪取相同部位的肝組織用 4%多聚甲醛固定，用于組織形態(tài)學(xué)分析；余下的肝組織保存于-80 ℃用著氧化應(yīng)激指標(biāo)和分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3.3 血液生化分析

取血漿，按試劑盒說明書介紹的方法檢測(cè)血液中GOT、GPT、TG、TC、FFA、HDL-C、LDL-C和UA的活性及含量。

1.3.4 血液GLU、胰島素、瘦素和脂聯(lián)素水平測(cè)定

取血漿，按試劑盒說明書介紹的方法檢測(cè)血液中GLU、胰島素、瘦素和脂聯(lián)素含量。

1.3.5 肝組織脂質(zhì)水平和氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

取肝組織，用生理鹽水制成10%勻漿后，離心，取上清液，檢測(cè)肝組織中FFA、TG、TC、HYP、HDL-C、LDL-C、MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量及活性。具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 肝形態(tài)學(xué)分析

取用 4%多聚甲醛中固定后的肝組織、用乙醇梯度脫水、石蠟包埋后，切片，H&E染色后光鏡下觀察；余下肝組織用著分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3.7 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)小鼠肝組織AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路信號(hào)通路mRNA表達(dá)量檢測(cè)

取肝組織，按照試劑盒說明書介紹的方法提取RNA，測(cè)定其純度和濃度；在 42 ℃ 2 min、37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，在25 μL體系中，按照95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、58 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)條件下進(jìn)行AMPKα、SIRT1、FASN、ACC-1、SREBP-1c、SCD-1、PPARγmRNA表達(dá)分析。

1.3.8 Western blotting檢測(cè)小鼠肝組織AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路信號(hào)通路蛋白表達(dá)量檢測(cè)

取肝組織，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，取等量蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、FASN、p-ACC-1、ACC-1、p-SREBP-1c、SREBP-1c、SCD-1和PPARγ蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，在SPSS 21.0和Graph Pad Prism 6.01軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；組間比較用 T-test，多組間比較用單因素方差分析；p＜0.05被認(rèn)為組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG對(duì)NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝質(zhì)量指數(shù)的影響

飲食結(jié)構(gòu)和遺傳因素，尤其是長期高脂飲食，它不僅可以引起體質(zhì)量上升、肝質(zhì)量和肝質(zhì)量指數(shù)增加，引起肝脂肪變性，進(jìn)而導(dǎo)致 NAFLD的發(fā)生[1]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食建立NAFLD ApoE-/-小鼠模型，模擬NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程，其結(jié)果接近臨床上成人NAFLD的病理生理改變。由圖2可知，NAFLD模型組小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝質(zhì)量指數(shù)均明顯增加，與正常組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）；用EGCG治療8周后，小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝質(zhì)量指數(shù)較模型組顯著降低至 110.98%、115.01%，115.64%、136.48%和 104.20%、118.70%，與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）；其中 EGCG-H 作用效果強(qiáng)于奧利司他（p＜0.05或p＜0.01）。上述結(jié)果提示，對(duì)NAFLD模型組小鼠使用EGCG干預(yù)后，可較好地降低體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝質(zhì)量指數(shù)，進(jìn)而防治肝脂肪變性和NAFLD的發(fā)生。

圖2 EGCG對(duì)NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝質(zhì)量指數(shù)的影響Fig.2 Effects of EGCG on body weight, liver mass and liver mass index in NAFLD mice

2.2 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝功能的影響

GOT、GPT、UA和HYP等是評(píng)估肝損傷的重要的生物標(biāo)志物，它們?cè)谘夯蚋谓M織中活性或含量升高是臨床醫(yī)生分析NAFLD發(fā)展與演變過程的重要依據(jù)，同時(shí)也是 NAFLD重要的臨床診斷指標(biāo)之一[6]。在本研究中，我們觀察到模型小鼠血液中GOT、GPT活性、UA含量和肝組織中HYP含量升高了153.11%、168.81%、166.58%和207.78%，與正常組比較均具有顯著性差異（p＜0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NAFLD模型小鼠出現(xiàn)了肝功能不全；而用EGCG（20、40 mg/kg）治療后，GOT、GPT活性和UA、HYP含量分別降低至116.71%、129.66%，115.34%、136.85%，112.45%、133.31%和114.94%、153.36%，與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）。研究證實(shí)EGCG可有效降低肝損傷GOT、GPT、UA和HYP生物標(biāo)志物，表明 NAFLD小鼠經(jīng) EGCG治療后肝功能得到改善（表2）。此研究與熊海容等[17]研究結(jié)果相似。

表2 EGCG對(duì)NAFLD小鼠脂和糖代謝及生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of EGCG on lipid, glycid metabolisms and biochemical indexes of NAFLD mice

2.3 EGCG對(duì)NAFLD小鼠脂質(zhì)代謝的影響

雖然目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制并未完全明確，但已有研究表明，當(dāng)某種原因引起胰島素抵抗導(dǎo)致脂代謝異常時(shí)，肝臟中FFA大量儲(chǔ)積，LDL-C合成與分泌發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致肝臟中TG、TC增加，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，導(dǎo)致NAFLD的啟動(dòng)；同時(shí)FFA濃度升高可以刺激高活性反應(yīng)分子性氧簇和活性氮簇生成增多，從而啟動(dòng)氧化應(yīng)激機(jī)制，進(jìn)一步促進(jìn)NAFLD發(fā)展，因此 FFA誘導(dǎo)下的脂代謝異常（如 TG、TC、LDL-C、FFA水平升高，HDL-C降低）被認(rèn)為是導(dǎo)致肝脂肪變性的重要促發(fā)因素[18,19]。基于此，我們分別檢測(cè)了血液和肝勻漿中的脂質(zhì)水平（表2）。與正常組比較，模型組血液和肝勻漿TG水平升高165.41%和275.89%、TC水平升高273.32%和621.92%、FFA水平升高254.85%和371.89%、LDL-C水平升高167.52%和 441.73%、LDL-C/HDL-C比值升高 380.04%和1499.24%，HDL-C水平降低 227.03%和 333.29%（p＜0.01），與Gan 等[1]研究結(jié)果相似；用EGCG（20、40 mg/kg）治療后，血液和肝勻漿 TG水平下降112.08%、138.14%和116.28%、183.54%，TC水平下降114.78%、177.74%和113.09%、182.56%，F(xiàn)FA水平下降 116.12%、161.73%和 122.68%、172.48%，LDL-C水平下降 113.53%、133.93%和 116.42%、177.27%，LDL-C/HDL-C比值下降139.92%、233.64%和135.28%、400.78%，HDL-C水平升高123.69%、174.34%和114.78%、222.19%，與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）；其中EGCG-H作用效果明顯強(qiáng)于奧利司他（p＜0.05或p＜0.01）。結(jié)果表明，EGCG對(duì)NAFLD小鼠血液或肝勻漿中的TG、TC、FFA、LDL-C、HDL-C及LDL-C/HDL-C比值均具有較好改善作用。

2.4 EGCG對(duì)NAFLD小鼠糖代謝的影響

眾所周知NAFLD的發(fā)病被認(rèn)為是胰島素抵抗相關(guān)性代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)[20]。NAFLD患者由于脂代謝異常，導(dǎo)致血液中瘦素持續(xù)升高，使瘦素受體敏感性降低，出現(xiàn)正常脂肪-胰島素軸正常的反饋機(jī)制破壞，引起胰島β細(xì)胞持續(xù)去極化、胰島素分泌增加，導(dǎo)致高瘦素和胰島素血癥；由于脂聯(lián)素是參與調(diào)控胰島素分泌的重要信號(hào)途徑，其分泌的減少會(huì)使肝臟氧化分解和攝取 GLU能力減弱，導(dǎo)致血液中 GLU和FFA含量升高。由此可見，NAFLD患者的高血脂是導(dǎo)致高瘦素、低脂聯(lián)素血癥的重要誘因，而高胰島素血癥又加速了這一進(jìn)程，從而形成脂質(zhì)和糖代謝彼此相互侵?jǐn)_，進(jìn)而參與脂肪肝的形成，脂肪肝本身又能加劇胰島素抵抗、促進(jìn)胰島素的分泌，形成了惡性循環(huán)[21]。如表2所示，模型組血液中瘦素、胰島素和GLU含量升高到320.60%、147.00%和154.37%，脂聯(lián)素降低至 316.79%，與正常組比較均具有顯著性差異（p＜0.01）；用EGCG（20、40 mg/kg）治療后，血液中瘦素、胰島素和GLU含量分別降低了23.20%、139.69%，48.14%、76.52%和32.39%、61.10%，脂聯(lián)素升高了11.85%、43.78%，與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）。此研究也與 Gan等人[1]報(bào)道相一致。

2.5 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝組織中內(nèi)源性抗氧化酶活性的影響

氧化應(yīng)激是NAFLD發(fā)生發(fā)展的主要因素，過多的氧自由基可加重脂肪變性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及造成肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肝損傷。因此，肝細(xì)胞的氧化損傷被認(rèn)為是誘發(fā)NAFLD的重要因素之一[22]。內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT可促進(jìn)H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，使O2-·、H2O2、OH·等自由基經(jīng)過歧化而被清除，使機(jī)體免受自由基的損傷，從而減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA的生成及對(duì)肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，因此肝組織MDA含量可間接反映肝細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[23,24]。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT活性下降了109.11%、125.77%、146.49%，MDA含量升高了703.8%，與正常組比較均具有顯著性差異（p＜0.01）；與Chen等[14]研究結(jié)果相似，用EGCG（20、40 mg/kg）治療后，SOD、GSH-Px、CAT活性升高了 17.49%、69.41%，12.62%、35.44%和17.98%、54.82%，MDA含量降低了20.65%、86.06%，與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）；有趣的是EGCG-L和EGCG-H作用效果均強(qiáng)于陽性藥奧利司他（p＜0.05或p＜0.01）。結(jié)果提示增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能是其防治NAFLD的重要特征之一（圖3）。

圖3 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝組織中內(nèi)源性抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of EGCG on endogenous antioxidant enzyme activity of liver tissue in NAFLD mice

2.6 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

NAFLD是一種病變主體在肝小葉，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲(chǔ)積為病理特征但無過量飲酒史的臨床綜合征，其發(fā)病由包括脂代謝異常、氧化應(yīng)激、炎癥等在內(nèi)的多種因素所致，上述病理在肝臟形態(tài)學(xué)中均有所體現(xiàn)[25]。在實(shí)驗(yàn)中，蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示的結(jié)果顯示與正常組相比，模型組小鼠肝組織可見肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變性、小葉炎癥、點(diǎn)狀局灶性壞死及大量的大脂肪滴積聚，這與Chyau等人[6]報(bào)道的結(jié)果相一致。肝組織形態(tài)學(xué)結(jié)果分析顯示，ApoE-/-小鼠 NAFLD 模型成功建立。EGCG（20、40 mg/kg）治療后肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪空泡和炎性細(xì)胞浸潤得到了顯著的改善，而奧利司他僅可部分緩解這些病變（圖4）。

2.7 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝組織AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路mRNA和蛋白表達(dá)的影響

AMPK是能量代謝調(diào)控的關(guān)鍵分子，在細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶等作用下，其α亞基第172位蘇氨酸被磷酸化（p-AMPKα）來抑制各種合成代謝途徑，減少細(xì)胞內(nèi)ATP的消耗；同時(shí)也可刺激分解代謝途徑，增加胞內(nèi)ATP產(chǎn)生，以恢復(fù)能量的穩(wěn)態(tài)[26]。此外，p-AMPKα還可通過增加細(xì)胞內(nèi) NAD+水平來增強(qiáng) SIRT1的活性，進(jìn)一步導(dǎo)致其下游靶分子/底物，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔活化因子-1α、ACC-1等磷酸化和失活，來調(diào)控葡萄糖代謝、脂肪酸氧化及減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[27]。近年來 AMPK/SIRT1通路在NAFLD發(fā)病中的作用也逐漸引起重視。研究表明AMPK作為調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的感受器，可以增強(qiáng)胰島素的敏感性，減少肝糖的輸出、并以磷酸化的形式抑制脂肪酸的合成和增強(qiáng)線粒體對(duì)脂肪酸的利用和氧化，來實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能[27,28]，SIRT1是一種依賴于 NAD+的去乙?；?，可促使多種蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?，促進(jìn)體內(nèi)脂類物質(zhì)的動(dòng)員，并參與肝臟糖異生，同時(shí)影響著胰島素的分泌功能[27,29]。由此可見，AMPK/SIRT1通路在糖脂質(zhì)代謝中起著重要作用。在本研究中，與正常組比較NAFLD模型小鼠肝組織中AMPKα、SIRT1 mRNA表達(dá)及p-AMPKα、SIRT1蛋白表達(dá)和p-AMPKα/AMPKα比率明顯分別降低了178.42%、196.38%，742.85%、234.34%和 704.69%（p＜0.01）；與 Chyau等[6]研究結(jié)果相似；用EGCG（20、40 mg/kg）治療后，AMPKα、SIRT1 mRNA表達(dá)及p-AMPKα、SIRT1蛋白表達(dá)和p-AMPKα/AMPKα比率分別升高了14.97%、64.81%，13.21%、68.78%，40.24%、75.82%，16.18%、67.40%和 39.20%、78.18%，與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）；其中EGCG治療效果明顯強(qiáng)于奧利司他（p＜0.05 或p＜0.01）（圖5a～b 和圖6a～d）。

SREBP-1c屬于“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”超家族的一員，主要在肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞表達(dá)，是參與脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要與脂肪酸和糖代謝有關(guān)，它調(diào)節(jié)的靶基因包括FASN、ACC-1、SCD-1等。在NAFLD時(shí)，失活A(yù)MPK降低了胰島素的敏感性，使得肝糖的輸出增加，導(dǎo)致SREBP-1c表達(dá)異常增高，進(jìn)而上調(diào)多個(gè)FASN生成相關(guān)酶，比如ACC-1、FASN、SCD-1的基因表達(dá)，從而使FFA和TG的合成增加，導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成增加、脂質(zhì)蓄積[30]。PPARγ是脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和胰島素細(xì)胞信號(hào)間傳遞的主要調(diào)節(jié)者，它對(duì)脂肪細(xì)胞的增生和分化起著正向調(diào)節(jié)作用；此外它還在介導(dǎo)脂肪酸氧化及脂質(zhì)代謝中起重要的作用[31]。當(dāng)肝細(xì)胞由于脂類沉積誘發(fā)脂肪變性后，肝臟中的PPARγ表達(dá)便會(huì)顯著升高，大量PPARγ表達(dá)促使脂質(zhì)合成基因的激活，導(dǎo)致肝臟更多脂質(zhì)的沉積[32]。類似的證據(jù)也表明，在患有NAFLD的肥胖患者的肝臟中上調(diào) SREBP-1c表達(dá)及其激活FASN、ACC-1、SCD-1在PPARγ作用下，促進(jìn)參與脂肪酸吸收、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因參與脂質(zhì)代謝，增加從頭脂肪酸生物合成、觸發(fā)肝臟脂肪變性，從而導(dǎo)致NAFLD發(fā)生發(fā)展[33-35]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD模型小鼠肝組織中 FASN、ACC-1、SREBP-1c、SCD-1、PPARγmRNA表達(dá)及FASN、p-ACC-1、p-SREBP-1c、SCD-1、PPARγ蛋白表達(dá)和 p-ACC-1/ACC-1、p-SREBP-1c/SREBP-1c比率升高了72.89%、73.78%、72.83%、69.19%、73.37%及62.13%、79.72%、73.54%、76.52%、73.50%及 80.30%、74.71%，與正常組比較具有顯著性差異（p＜0.01），與Chyau等[6]研究結(jié)果相似；用EGCG（20、40 mg/kg）治療后，F(xiàn)ASN、ACC-1、SREBP-1c、SCD-1、PPARγmRNA 表達(dá)及 FASN、p-ACC-1、p-SREBP-1c、SCD-1、PPARγ蛋白表達(dá)和p-ACC-1/ACC-1、p-SREBP-1c/SREBP-1c比率明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05或p＜0.01）；其中 EGCG治療效果明顯強(qiáng)于奧利司他（p＜0.05或p＜0.01）（圖5c～g 和圖6e～k）。

圖5 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝組織AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of EGCG on the mRNA expressions of AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ signaling pathway of liver tissue in NAFLD mice

圖6 EGCG對(duì)NAFLD小鼠肝組織AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of EGCG on the protein expressions of AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ signaling pathway of liver tissue in NAFLD mice

3 結(jié)論

NAFLD已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的第一大肝病，其危害不僅可以進(jìn)展為非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌，而且是代謝綜合征的重要組分和與心腦血管疾病密切相關(guān)，患者常常伴隨血脂異常、糖脂代謝紊亂、炎癥和氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD模型組的小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝質(zhì)量指數(shù)、血液中 GOT、GPT、TG、TC、LDL-C、FFA、GLU、瘦素、胰島素水平和肝組織中UA、HYP、MDA水平均明顯高于正常組，血液中HDL-C、脂聯(lián)素水平和肝組織中SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯低于正常組；H&E染色發(fā)現(xiàn)NAFLD模型小鼠肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變性、小葉炎癥、點(diǎn)狀局灶性壞死及大量的大脂肪滴積聚，實(shí)驗(yàn)提示NAFLD模型成功建立。EGCG治療后上述異常的血脂、紊亂的糖脂代謝和肝臟組織病理學(xué)變化均得到了明顯改善；實(shí)時(shí)定量 PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明EGCG可通過調(diào)控AMPK/SIRT1/SREBP-1c/PPARγ信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)參與脂肪酸和葡萄糖吸收、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因參與糖脂代謝、脂肪酸氧化，抑制從頭脂肪酸生物合成、減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而遏制NAFLD發(fā)生發(fā)展。本研究為EGCG防治NAFLD提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與防治思路。