李原，趙振剛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

鳳眼果（Sterculia nobilisSmith）是屬于梧桐科蘋婆屬的一種木本植物，在日本、東南亞和中國華南地區(qū)廣泛分布[1]。鳳眼果種子的外形和風(fēng)味與板栗相似，但鳳眼果種子香甜、多汁的口感卻比板栗更勝一籌。在廣東、廣西地區(qū)鳳眼果種子被當(dāng)作一種可食用的水果，受到人們的喜愛，因此具有極高的食用價值。鳳眼果種子富含蛋白質(zhì)，淀粉，維生素，多酚和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，此前有研究表明鳳眼果種子具有較好的抗氧化和胃保護(hù)作用[1-3]。鳳眼果殼別名鳳眼果莢、蘋婆殼，常見的鳳眼果殼為橢圓形，具有皮革質(zhì)感，通常鳳眼果殼于每年的六月到八月成熟，成熟時表皮為紅色，短絨毛狀[2]。鳳眼果殼作為一種中藥被多本中藥書籍所記錄，如《中藥本草》等[4]，具有較高的藥用價值。然而，目前對于鳳眼果殼的加工利用率不高，研究也尚為缺乏。

作為植物重要的次生代謝產(chǎn)物，多酚類化合物在植物生長發(fā)育過程中起著相當(dāng)重要的作用。許多研究表明植物多酚類化合物具有較好的抗氧化活性[5-7]，同時也有研究表明植物多酚類化合物具有較好的抗癌細(xì)胞增殖活性[8-10]。已有研究測定通過浸漬、索氏提取、微波輔助提取三種方法鳳眼果殼提取物的總多酚和總黃酮含量，其總多酚含量分別為2.74±0.69、2.56±0.64和3.67±0.80 mg GAE/g DW，總黃酮分別為0.30±0.17、0.24±0.10和0.45±0.13 mg QE/g DW，同時鑒定出鳳眼果殼提取物含有的多酚類化合物主要包括表兒茶素，原兒茶酸，阿魏酸，沒食子酸，對香豆酸，咖啡酸，槲皮素和對羥基肉桂酸，同時該提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化活性[11]。但目前暫時還沒有對鳳眼果殼抗癌細(xì)胞增殖活性的相關(guān)報道。作為一種天然可再生的多酚化合物來源，鳳眼果殼中仍存在多種多酚類化合物及其活性未被研究報道。同時，鳳眼果殼作為一種食品工業(yè)的副產(chǎn)物，人們可以通過低成本獲得，并回收其活性物質(zhì)，屬于一種可再生資源，因此，其利用價值不可被忽視。本文對鳳眼果殼游離態(tài)、結(jié)合態(tài)和萃取后的四相提取物的總多酚和總黃酮含量進(jìn)行測定，同時測定結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物的抗氧化活性，對乙酸乙酯相提取物的多酚化合物進(jìn)行鑒定并探究其抗A549細(xì)胞增殖活性，以期為鳳眼果殼的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鳳眼果殼購自中國廣州的當(dāng)?shù)厥袌?，用蒸餾水洗凈，切成小片，曬干。使用實(shí)驗(yàn)室研磨機(jī)磨成細(xì)粉，過60目篩。得到的粉末存放于干燥皿內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：表兒茶素、香草酸、異葒草素、阿魏酸、（反）阿魏酸、蘆丁、槲皮苷、楊梅素、三葉苷、槲皮素和山奈酚、沒食子酸、兒茶素水合物、福林酚試劑，美國 Sigma公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2’-偶氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽（ABTS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，ATCC公司；磷酸鹽（PBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液，碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，浙江天航生物科技有限公司；95%乙醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、碳酸鈉、硼氫化鈉、三氯化鋁、四氯代苯對醌、四氫呋喃（THF）、乙酸、鹽酸、香草醛、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇、磷酸氫二鉀均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500搖擺式中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；Basis Hei-VAP Value真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；MX-RL-PRO 靜音混合儀，MX-RL-PRO；DU730核酸蛋白質(zhì)分析儀，美國Beckman Coulter公司；Filter Max F5多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；Allegra X-15R臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鳳眼果殼游離多酚的提取與分離

游離態(tài)多酚提取參考 Wen等[12]報道的方法并稍作修改，稱取一定量的鳳眼果殼粉末樣品，按照一定液料比（1:3，m/V）加入95%乙醇溶液，浸泡，抽濾，得到的濾液通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，濾渣備用。旋蒸獲得的膏狀液，取一部分為乙醇提取物備用，另一部分用蒸餾水稀釋后依次采用有機(jī)溶劑正己烷、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行分相萃取，體積比為 1:1，每相萃取3次，收集萃取后獲得的液體。將得到的各有機(jī)相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，得到正己烷相（HF）、乙酸乙酯相（EAF）、正丁醇相（BF）和水相（AqF）四個部分。

1.3.2 鳳眼果殼的結(jié)合態(tài)多酚的提取

結(jié)合態(tài)多酚的提取參考 Wen的方法[13]并稍做修改，稱取1.3.1的濾渣10.1757 g，分裝至50 mL離心管中，向裝有沉淀物的離心管中加入10 mL NaOH溶液（4 M），將離心管放在靜音混合儀上充分混合1.5 h，轉(zhuǎn)速為60 r/min；混合結(jié)束后，在通風(fēng)櫥中加濃鹽酸調(diào)pH至2.0并加入等體積的乙酸乙酯，混勻，以5000 r/min離心15 min，每次將上清液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中混合搖勻，重復(fù)萃取直至乙酸乙酯相澄清。將收集的萃取液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在 45 ℃下旋蒸。加入超純水定容至25 mL，低溫下保存。

1.3.3 總酚含量測定

使用Wang等[14]報道的福林酚比色法測定每個樣品的總酚含量，使用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。配置一系列濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（20～600 μg/mL），將樣品稀釋到合適濃度。然后加入100 μL福林酚試劑。充分震蕩混合后，將混合物靜置 6 min，然后在避光條件下與1 mL Na2CO3（W/W，7%）反應(yīng)90 min。反應(yīng)過后，使用核酸蛋白質(zhì)分析儀在730 nm下測定混合物的吸光度。繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到回歸方程：Y=0.0037X+0.0264，R2=0.9992。通過回歸方程計(jì)算各相提取物的兒茶素當(dāng)量，所有測定均重復(fù)三次。各相提取物的總酚含量的結(jié)果表示為mg沒食子酸當(dāng)量/100 g DW(mg GAE/100 g DW)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Reference curve of gallic acid

1.3.4 總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定參考Zhao等[15]道的硼氫化鈉-四氯苯醌法進(jìn)行測定，使用兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。將適量的兒茶素和樣品溶于1 mL THF：乙醇（1:1，V/V）溶液中，配制成一系列濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（0.3～10 mg/mL),并將樣品稀釋到合適濃度。分別向兒茶素/樣品中加入0.5 mL的50.0 mM NaBH4溶液和0.5 mL的74.6 mM AlCl·6H2O并振蕩溶液30 min。然后加入0.5 mL的50.0 mM的NaBH4溶液，振蕩30 min。分別加入2.0 mL的0.8 mM冰乙酸溶液，并在避光的條件下振蕩15 min。隨后加入1 mL 20 mM氯苯甲烷溶液，使混合物在95 ℃下反應(yīng)1 h，然后取出試管使其冷卻，加入甲醇至總體積為4 mL。加入1 mL 16%（W/V）的香蘭素和2 mL 12 M的HCl溶液，混勻并在避光條件下放置15 min，然后使用核酸蛋白質(zhì)測定溶液在490 nm處的吸光值，所有測定均重復(fù)三次。通過繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）得到回歸方程：Y=0.1531X-0.006，R2=0.9991。通過方程計(jì)算兒茶素當(dāng)量，各樣品的總黃酮含量表示為mg兒茶素當(dāng)量/100 g DW (mg CE/100 g DW)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖2 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Reference curve of catechin

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性的測定

參考 Zhao等人[16]的方法測定各相提取物的DPPH自由基清除活性。稱取0.019 g的2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基粉末溶于25 mL無水乙醇中以配制DPPH儲備溶液（2 mM），在4 ℃避光儲存。使用前用無水乙醇稀釋DPPH儲備液至0.2 mM作為DPPH工作液。用無水乙醇溶液將樣品稀釋到 0.5～5 mg/mL，將 Vc溶液稀釋到10～100 μM，取1 mL稀釋后的Vc溶液或樣品，等量與DPPH工作液混合均勻。在黑暗條件下于25 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)后，通過核酸蛋白質(zhì)分析儀在517 nm下測定溶液的吸光度。以Vc溶液用作陽性對照。DPPH的自由基清除率按照公式（1）計(jì)算。

其中，As為樣品組，Ac為不含樣品的對照組的吸光度，A0為不含樣品的DPPH工作溶液的吸光度。

1.3.5.2 ABTS自由基清除活性的測定

參考 Zheng等[17]人的方法測定各相提取物的ABTS自由基清除活性。鳳眼果殼的各相提取物和Vc溶液用無水乙醇稀釋至不同濃度。分別配制 50 mL ABTS溶液（7 mM）和50 mL過硫酸鉀溶液（4.9 mM），混合均勻。將混合液在25 ℃下避光放置16 h，作為ABTS儲備液。在實(shí)驗(yàn)前，把ABTS儲備液用無水乙醇溶液稀釋到適當(dāng)濃度，當(dāng)在734 nm處測定到的吸光值為0.700±0.02時該工作液即可使用。用無水乙醇溶液將樣品稀釋到5～100 mg/mL，將抗壞血酸溶液稀釋到200～3000 μM，加入20 μL稀釋后的樣品溶液或Vc溶液到試管中，加入2 mL的ABTS工作液在避光條件下混合均勻，隨后避光靜置15 min。以Vc作為陽性對照。通過核酸蛋白質(zhì)分析儀在734 nm下測定溶液的吸光值。ABTS自由基抑制率按照公式（2）計(jì)算。

其中，Ac為不加樣品的空白對照組的吸光值，As為樣品加入ABTS工作液的吸光值，A0為不含樣品的ABTS工作液的吸光值。

1.3.5.3 還原力測定

測定各相提取物的還原力參考文獻(xiàn)報道的方法[18]并稍作修改：用超純水分別配制的磷酸鹽緩沖溶液（0.2 M，pH=6.6）、1%（m/V）的鐵氰化鉀溶液、10%（V/V）的三氯乙酸溶液以及0.1%（V/V）的三氯化鐵溶液。樣品或Vc溶液用磷酸緩沖溶液稀釋至不同濃度。用無水乙醇溶液將樣品稀釋到1～10 mg/mL，將抗壞血酸溶液稀釋到20～300 μM，加入2 mL樣品溶液或Vc溶液到試管中，然后加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液和2 mL鐵氰化鉀溶液，混合均勻?；靹蚝?，將試管置于50 ℃的水浴鍋中水浴加熱20 min，然后加入2 mL的三氯乙酸溶液于試管?；靹?，以3000 r/min的速度離心10 min，取2 mL上清液加入到新的試管，加入2 mL超純水和0.4 mL三氯化鐵，混勻，室溫反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，以Vc作為陽性對照，用核酸蛋白質(zhì)分析儀測定其在700 nm處的吸光值。

1.3.6 HPLC分析鳳眼果殼乙酸乙酯相提取物的多酚類化學(xué)成分

將鳳眼果殼的乙酸乙酯相提取物溶解到甲醇中，該溶液通過孔徑為0.45 μm過濾膜過濾并注入HPLC系統(tǒng)。WATERS的HPLC系統(tǒng)配備WATERS的C18色譜柱的（5 μm，4.6 mm×250 mm）。樣品的進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.5 mL/min。用溶液A（0.1% TFA）和溶液B（甲醇）洗脫多酚類化合物。溶劑A和B的比率（V/V）的梯度如下：從0～1 min，0% B；1～60 min，0%～100% B；60～62 min，0% B。以樣品的出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間進(jìn)行比對，通過相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線計(jì)算化合物的含量。多酚化合物的含量以mg/100 g DW of EAF表示。

1.3.7 鳳眼果殼乙酸乙酯相提取物的抗增殖活性測定

1.3.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，代數(shù)為8～20代。培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基中，并向其中加入10%的四季青胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液。細(xì)胞在37 ℃，含有5% CO2的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.7.2 乙酸乙酯相提取物的毒性評價

參考 Felice等人[19]報道的亞甲基藍(lán)測定法測定細(xì)胞毒性。先用培養(yǎng)基稀釋EAF至0～100 μg/mL。將細(xì)胞以4×104個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種在96孔板上。在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育24 h后，除去培養(yǎng)基，并向每個孔中添加100 μL不同濃度的EAF。加入100 μL沒有樣品的培養(yǎng)基作為對照組。孵育24 h后，除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL PBS洗滌，棄去洗液，添加50 μL亞甲藍(lán)溶液染色細(xì)胞。1 h后，除去亞甲藍(lán)溶液，用清水洗凈96孔板，拍干并加入100 mL洗脫液（含有49% PBS，50%乙醇和1%乙酸）到每個孔中，震蕩20 min。將96孔板放置在多功能酶標(biāo)儀中，在570 nm下測量每孔的吸光度。細(xì)胞毒性按照公式（3）計(jì)算。

其中，As是樣品孔處理量減去空白孔的吸光度，Ac是對照孔減去空白孔的吸光度。

1.3.7.3 乙酸乙酯相提取物的抗增殖活性

根據(jù)由Li等[20]報道的方法測量抗增殖活性。先用培養(yǎng)基稀釋 EAF至 0～100 μg/mL。將癌細(xì)胞以2.5×104個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種在96孔板上，并在CO2培養(yǎng)箱中于孵育4 h。然后除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL不同濃度的EAF。加入100 μL沒有樣品的培養(yǎng)基作為對照組。孵育72 h后，除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL PBS洗滌，棄去洗液，并添加50 μL亞甲藍(lán)溶液染色細(xì)胞。1 h后，除去亞甲藍(lán)溶液，用清水洗凈96孔板，拍干并加入100 mL洗脫液（含有49% PBS，50%乙醇和1%乙酸）到每個孔中，震蕩20 min。將96孔板放置在多功能酶標(biāo)儀中，在570 nm下測量每孔的吸光度。細(xì)胞增殖抑制率按照公式（4）計(jì)算。

其中，As為樣品孔減去空白孔的吸光度，Ac為對照孔減去空白孔的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017繪圖，用CalcuSyn計(jì)算EC50值，采用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件并采用Duncan’s檢測對各個變量進(jìn)行ANOVA分析，p＜0.05時，表明具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過三次重復(fù)試驗(yàn)測定之后計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 鳳眼果殼各相提取物的總多酚和總黃酮含量

鳳眼果殼游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的總多酚和總黃酮含量如圖3所示。鳳眼果殼游離態(tài)的總多酚和總黃酮含量高于結(jié)合態(tài)的總多酚和總黃酮含量。其中，鳳眼果殼游離態(tài)多酚含量為468.18 mg GAE/100 g DW，黃酮含量為2063.49 mg CE/100 g DW。結(jié)合態(tài)多酚含量為107.22 mg GAE/100 g DW，黃酮含量為666.45 mg CE/100 g DW，游離態(tài)總多酚含量是結(jié)合態(tài)的4.36倍，總黃酮含量是結(jié)合態(tài)的3.10倍。表明鳳眼果殼的多酚和黃酮類化合物主要存在于游離態(tài)中。

圖3 游離態(tài)、結(jié)合態(tài)的總多酚和總黃酮含量Fig.3 Total phenolic contents and total flavonoid content of free fraction and bound fraction

圖4 四相提取物的總多酚和總黃酮含量Fig.4 Total phenolic contents and total flavonoid content of four fractions

萃取后的四相提取物的總多酚和總黃酮含量如圖4所示，四相提取物總多酚含量大小次序?yàn)椋篍AF＞AqF＞BF＞HF ， 總 黃 酮 含 量 大 小 次 序 為EAF＞HF＞AqF＞BF，結(jié)果表明鳳眼果殼的各相提取物均含有一定量的多酚和黃酮類化合物，同時發(fā)現(xiàn)EAF的總多酚和總黃酮含量高于其他三相提取物,表明較多的多酚和黃酮類物質(zhì)被乙酸乙酯萃取到EAF當(dāng)中。Zheng等[21]在研究甘蔗渣多酚時發(fā)現(xiàn)，甘蔗渣提取得到的乙酸乙酯相的多酚含量高于石油醚，正丁醇相和水相，該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。同時胡惠剛等[22]在研究芒果多酚的提取分離時也發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相的多酚含量高于石油醚，正丁醇相和水相，結(jié)果與本研究結(jié)果相似。上述研究結(jié)果對鳳眼果殼提取物的分離提供了一定的理論基礎(chǔ)，同時為后續(xù)對鳳眼果殼各相提取物的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

2.2 鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力比較

圖5 結(jié)合態(tài)多酚、萃取后的四相提取物和Vc的DPPH自由基清除能力Fig.5 The DPPH radical scavenging activity of boundextract,four fractions extract and Vc

鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚、萃取后的四相提取物和Vc的DPPH自由基清除能力如圖5所示，在提取物濃度為0.5～5 mg/mL時，結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物的DPPH自由基清除能力均隨樣品濃度的增大而增強(qiáng)?？寡趸瘎￢c的DPPH自由基清除能力高于五相不同提取物。在結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物中，EAF的DPPH自由基清除能力顯著高于其他四相提取物（p＜0.05），其 EC50值為 2.08 mg/mL。AqF和 HF的DPPH自由基的清除能力大小無顯著性差異，EC50值分別為3.19 mg/mL和3.21 mg/mL。BF的DPPH自由基的清除能力大于結(jié)合態(tài)多酚提取物，其EC50值為6.26 mg/mL，結(jié)合態(tài)多酚的EC50值為7.87 mg/mL。結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物對DPPH自由基的清除能力大小次序?yàn)镋AF＞AqF＞HF＞BF＞結(jié)合態(tài)多酚。

2.2.2 ABTS自由基清除能力比較

鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚、萃取后的四相提取物和Vc的ABTS自由基清除能力如圖6所示，抗氧化劑Vc的ABTS自由基清除能力高于鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物，結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物的ABTS自由基清除率與樣品濃度成正相關(guān)，其中ABTS自由基清除能力最強(qiáng)的是AqF，其EC50值為8.51 mg/mL。EAF的 ABTS自由基清除能力僅次于AqF，其EC50值為29.28 mg/mL。結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物對ABTS自由基的清除能力大小次序?yàn)锳qF＞EAF＞HF＞結(jié)合態(tài)多酚＞BF。

圖6 結(jié)合態(tài)多酚、萃取后的四相提取物和Vc的ABTS自由基清除能力Fig.6 The ABTS radical scavenging activity ofbound extract,four fractions extract and Vc

2.2.3 還原力比較

圖7 結(jié)合態(tài)多酚、萃取后的四相提取物和Vc的還原力Fig.7 The reducing power of bound extract,four fractions extract and Vc

鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相還原力結(jié)果如圖7所示，抗氧化劑Vc的還原力高于鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物，還原力大小與各樣品濃度成線性相關(guān)。在結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物中，EAF的還原力顯著高于其他四相提取物，在樣品濃度為10 mg/mL時，EAF的還原力達(dá)到0.81。AqF的還原力次之，結(jié)合態(tài)多酚的還原力大于HF的還原力，在樣品濃度為10 mg/mL時，結(jié)合態(tài)多酚的還原力為 0.39，HF還原力只有 0.32。結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物對還原力大小次序?yàn)镋AF＞AqF＞BF＞結(jié)合態(tài)多酚＞HF，與各相提取物的總多酚含量的大小次序一致。

利用Pearson相關(guān)性分析對鳳眼果殼結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物的總多酚含量（TPC）、總黃酮含量（TFC）以及3種抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPC與還原力測定結(jié)果顯著正相關(guān)（r=0.989，p＜0.01）。此外，還發(fā)現(xiàn)TFC與DPPH測定結(jié)果顯著正相關(guān)（r=0.960，p＜0.01）。另外，從相關(guān)性分析結(jié)果中可知結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物的TPC、TFC和其他抗氧化測定結(jié)果與ABTS法測定的結(jié)果相關(guān)性較低，這可能與不同的抗氧化活性方法的測定原理以及樣品與抗氧化劑作用方式有關(guān)。

綜合DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力的抗氧化活性的測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力。Zhang等[11]通過TEAC法測定鳳眼果殼的抗氧化活性，結(jié)果表明鳳眼果殼提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。綜合四相提取物的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在結(jié)合態(tài)多酚和萃取后的四相提取物中 EAF擁有最高的總酚、總黃酮含量和最強(qiáng)抗氧化活性，EAF表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化活性與其含有的多酚黃酮類化合物有關(guān)。選擇EAF作為優(yōu)選組分，進(jìn)一步探究其多酚化合物的組成及抗人肺癌細(xì)胞A549增殖活性。

2.2.4 鳳眼果殼乙酸乙酯相提取物的多酚類化學(xué)組成

表1 通過HPLC在EAF中檢測到的多酚類化合物Table 1 Phenolic compounds that have been detected in EAF by HPLC

由圖8可知，乙酸乙酯相提取物含有的多酚類化合物主要包括表兒茶素、香草酸、異葒草素、阿魏酸、（反）阿魏酸、蘆丁、槲皮苷、楊梅素、三葉苷、槲皮素和山奈酚。多酚化合物的含量如表1所示，其中含量最高的是蘆丁，接著是三葉苷和異葒草素。此前Zhang等[11]報道了從鳳眼果殼提取物鑒定出八種多酚類化合物，包括表兒茶素、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、對香豆酸、咖啡酸、槲皮素和對羥基肉桂酸，并對其分別進(jìn)行定量，其中表兒茶素和原兒茶酸的含量高于其他6種多酚類化合物，分別為56.6 μg/g DW和21.1 μg/g DW。其中鑒定出來的表兒茶素、阿魏酸和槲皮素與我們本次鑒定的結(jié)果一致。植物含有的多酚及黃酮類物質(zhì)因其良好的抗氧化活性等特性受到廣泛關(guān)注，如蘆丁、表兒茶素、槲皮素等均具有較好的抗氧化活性[23-25]，乙酸乙酯相提取物所表現(xiàn)出的抗氧化活性與其含有的多酚類化合物具有一定的聯(lián)系。

圖8 乙酸乙酯相提取物和標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相分析圖Fig.8 The chromatogram for EAF and the standards

2.2.5 鳳眼果殼乙酸乙酯相提取物的抗增殖活性

選擇抗氧化活性較好的EAF，測定EAF對人肺癌細(xì)胞A549的抗增殖作用。結(jié)果如圖9所示，與對照組相比，乙酸乙酯相提取物對A549細(xì)胞的增殖具有劑量依賴性抑制作用。當(dāng)EAF的濃度為0～50 μg/mL時，對A549細(xì)胞的增殖抑制率并不明顯，抑制率在20%以下。當(dāng)EAF的濃度為60 μg/mL時，A549細(xì)胞的增殖抑制率為24.84%。EAF濃度達(dá)到70 μg/mL時，A549細(xì)胞的增殖抑制率為47.47%。EAF的濃度達(dá)到100 μg/mL時，對 A549細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到64.72%。同時從EAF對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EAF提取物的濃度為0～90 μg/mL時，細(xì)胞毒性均小于10%，當(dāng)濃度達(dá)到100 μg/mL時，細(xì)胞毒性為17.33%，說明EAF提取物的濃度為0～90 μg/mL時，EAF的細(xì)胞毒性對A549細(xì)胞的增殖影響較小。通過計(jì)算可得到EAF抑制A549細(xì)胞增殖的EC50值為85.70±3.60 μg/mL。已有研究表明槲皮素能有效抑制癌細(xì)胞的增殖[26]，Anna等[27]通過MTT法測定槲皮素抑制A549細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞生長受到50%抑制時，槲皮素的濃度為22.35 μg/mL，與本研究相比，槲皮素對 A549細(xì)胞的增殖抑制能力強(qiáng)于 EAF，是EAF的 3.83倍，同時也說明 EAF具有較好的抑制A549細(xì)胞的增殖的能力。除了槲皮素之外，表兒茶素、槲皮苷等多酚類化合物均被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗癌細(xì)胞增殖活性，表兒茶素的抗癌細(xì)胞增殖活性與其抗氧化活性、抗血管生成作用及其細(xì)胞毒性有關(guān)[28]，槲皮苷能通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)抑制肺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其發(fā)生細(xì)胞凋亡[29]。此外，乙酸乙酯相中含有其他的有效成分，如山奈酚和蘆丁等多酚化合物都是具有抗癌細(xì)胞增殖活性的常見化合物[30,31]，因此，乙酸乙酯相提取物含有的多酚類化合物與其抗增殖活性具有重要聯(lián)系。

圖9 EAF對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗增殖活性Fig.9 The cytotoxicity and antiproliferative activities of EAF against A549 cells

3 結(jié)論

結(jié)果顯示鳳眼果殼游離態(tài)多酚的總多酚和總黃酮含量比結(jié)合態(tài)多酚高，表明鳳眼果的多酚和黃酮類化合物主要以游離態(tài)的形式存在。在萃取后的四相提取物中，乙酸乙酯相提取物的總多酚和總黃酮含量最高。綜合DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力三個抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相提取物的抗氧化能力高于結(jié)合態(tài)多酚和其它三相萃取后的提取物。此外，乙酸乙酯相提取物顯示出對人肺癌細(xì)胞A549的劑量依賴性抑制作用。從這項(xiàng)研究獲得的結(jié)果表明，鳳眼果殼的多酚和黃酮類化合物主要以游離態(tài)的形式存在，同時鳳眼果殼多酚提取物具有較好的抗氧化和抗人肺癌細(xì)胞A549增殖活性，可發(fā)現(xiàn)鳳眼果殼是天然多酚類化合物的潛在來源，并且可能有助于開發(fā)新的如抗氧化劑，抗癌潛在藥物等功能性試劑，為鳳眼果殼后期的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。