羅玉霜，伍靜儀，劉世鋒，康信聰，王蕾，張志旭,4，劉東波,4,5

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長沙 410128）（2.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實驗室，湖南長沙 410128）（3.長沙能峰生物科技有限公司，湖南長沙 410128）（4.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）（5.湖南作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南長沙 410128）

腸道是人體巨大的微生態(tài)系統(tǒng)，定植于腸道的微生物集合統(tǒng)稱為腸道菌群[1]。正常情況下，腸道各菌屬組成及數(shù)量處于健康的平衡狀態(tài)，形成與人體密不可分的互利共生關(guān)系，從而維持宿主正常的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、免疫功能等。若菌群結(jié)構(gòu)改變或失調(diào)，即腸道內(nèi)益生菌減少、致病菌增加，即引起機體代謝紊亂，導(dǎo)致糖尿病等多種疾病的發(fā)生[2]。目前國內(nèi)外對藥物與腸道菌群的相互作用研究已成為熱點。橘皮湯首載于《金匱要略》，由陳皮、生姜組成，其主要成分為橙皮苷、川陳皮素及6-姜酚，常用于治療胃中寒冷、嘔吐惡心、呃逆噯氣[3]。楊志宏等[4]發(fā)現(xiàn)橘皮湯可對抗化療后所致的惡心與嘔吐。姜明旭等[5]發(fā)現(xiàn)服用橘皮湯配以針刺對治療顱腦術(shù)后頑固性呃逆有顯著療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為，胃腸道消化系統(tǒng)與嘔吐、呃逆、噯氣等癥狀直接相關(guān)。而目前對橘皮湯的研究主要集中在生姜、陳皮及其組方的藥物動力學(xué)及臨床降逆止嘔功能方面，對橘皮湯作為藥食同源的中藥食材在胃腸道中影響的研究較少。

SHIME[6-8]（Simulator of human intestinal microbial ecosystem）系統(tǒng)是比利時根特大學(xué)設(shè)計的人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)模擬裝置，是一種人體體外胃腸道微生態(tài)模擬系統(tǒng)，包括模擬消化系統(tǒng)、蠕動泵系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、pH調(diào)節(jié)系統(tǒng)。由于能夠有效模擬人體的消化及腸道微生態(tài)環(huán)境，從而受到越來越多研究者的關(guān)注，如Katia Sivieri利用SHIME評估新鮮橙汁和巴氏殺菌橙汁對腸道菌群及短鏈脂肪酸的影響[9]；Ana M.Rovalino-Córdova利用SHIME研究豆類結(jié)構(gòu)對微生物群利用植物營養(yǎng)素的影響[8]；Lei Liu利用SHIME研究萬古霉素對腸道菌群的致病作用[10]等。腸道菌群影響機體的主要方式之一是產(chǎn)生短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維的終產(chǎn)物，是碳原子數(shù)為1～6溶于水的游離脂肪酸，是微生物自身及宿主腸上皮細胞的能量來源，促進細胞生長，抑制有害菌的生長[11]。本研究基于SHIME系統(tǒng)，通過16S rRNA高通量測序技術(shù)分析橘皮湯對腸道菌群的影響，通過氣相色譜技術(shù)分析橘皮湯對腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的影響。為橘皮湯的食療功能提供有效的數(shù)據(jù)支持，及其保健品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

XS205十萬分之一分析天平，德國 METTLER TOLEDO公司；QL-901 Vortex渦混儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；2-16R高速冷凍離心機，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；PL403分析天平，METTLER TOLEDO；雙列六孔水浴鍋與SHIME系統(tǒng)，北京佳德精密科技有限公司。

1.1.2 試劑

阿拉伯半乳聚糖、木聚糖、胰蛋白酶、生物素、泛酸鹽、煙酰胺、硫胺、甲萘醌、對-氨基苯甲酸，上海源葉生物科技有限公司；淀粉、葡萄糖、半胱氨酸、碳酸氫鈉、吐溫80、氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、七水硫酸鐵、七水硫酸鈷、七水硫酸鋅、五水硫酸銅、硫酸鋁鉀、硼酸、鉬酸鈉、氯化鎳、亞硒酸鈉、維生素B12、氯化鈉、胃蛋白酶、36.5%濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉，上海盛思生化科技有限公司；細菌學(xué)蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；果膠，河南三化生物科技有限公司；血紅素、PBS固體粉末（BOMEI），豬膽鹽，麥克林。

標準品：乙酸（批號：J1811168）、丙酸（批號：G1827115）、正丁酸（批號：50504）、異丁酸（批號：D1713230）、正戊酸（批號：H1822061）、異戊酸（批號：K1813199）、己酸（批號：E1811088）、2-乙基丁酸（批號：C10506873）、共計8個，正丁酸，上海源葉生物科技有限公司；乙酸、丙酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、己酸、2-乙基丁酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 食材

生姜，長沙濱湖大市場；陳皮，養(yǎng)天和大藥房。

1.3 方法

1.3.1 橘皮湯的制備

稱取生姜10 g，陳皮5 g，以6倍量的蒸餾水，加熱回流提取2 h，趁熱過濾；藥渣再以6倍量的蒸餾水加熱回流提取2 h。合并提取液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 模擬消化方法

系統(tǒng)模擬實驗方法包括：系統(tǒng)時間、速度及其他參數(shù)設(shè)定，糞便接種液制備，腸道微生態(tài)的增值和穩(wěn)定，胃和小腸消化液、營養(yǎng)液制備，以及模擬消化步驟[12,13]。

消化液及食物營養(yǎng)液制備：消化液的制備為胃液和胰液的配置與儲存。胃液的配置方法：準確稱取2.0 g NaCl、3.2 g胃蛋白酶以及7 mL 36.5%濃鹽酸，無菌蒸餾水定容至 100 mL。胰液的配置方法：準確稱取6.0 g膽汁鹽、0.9 g胰蛋白酶、12.5 g碳酸氫鈉，無菌蒸餾水定容至1000 mL。配置好的消化液貼好標簽置于4 ℃冰箱保存。

食物營養(yǎng)液的制備為基礎(chǔ)營養(yǎng)液、微量元素液、維生素液的配置與儲存。基礎(chǔ)營養(yǎng)液配置方法：稱取3.0 g淀粉、0.4 g葡萄糖、2.0 g果膠、1.0 g阿拉伯半乳聚糖、1.0 g木聚糖、3.0 g酵母提取物、0.4 g碳酸氫鈉、4.0 g蛋白胨、0.5 g半胱氨酸、1 mL吐溫80，無菌蒸餾水定容至1000 mL。微量元素①液配置方法稱：取1.0 g磷酸氫二鉀、0.125 g血紅素、2.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鈣、0.2 g七水合硫酸鎂，無菌蒸餾水定容至250 mL。微量元素②液配置方法：稱取0.1 g硼酸、0.1 g亞硒酸鈉、5.0 g二水合硫酸錳、1.0 g硫酸鈷、0.1 g鉬酸鈉、1.0 g六水合氯化鎳、0.1 g硫酸鋁、0.1 g五水合硫酸銅、1.0 g硫酸鋅、1.0 g七水合硫酸鐵，無菌蒸餾水定容至100 mL。維生素液配置方法：稱取0.25 g煙酰胺、0.2 g硫胺、0.25 g對-氨基苯甲酸、0.025 g維生素B12、0.5 g泛鹽酸、0.05 g甲萘醌、0.1 g生物素，無菌蒸餾水定容至50 mL。配置好的食物營養(yǎng)液貼好標簽置于4 ℃冰箱保存待用。基礎(chǔ)營養(yǎng)液與微量元素液以及維生素液按照體積比 1000:10:10:1混合成食物營養(yǎng)液。

糞便接種液的制備：采集1名年齡在20～35歲，并且在過去半年未使用抗生素藥物的健康宿主。稱取新鮮糞便50 g加入250 mL接種液（無菌PBS緩沖液0.1 M，pH=7.4），渦混儀上混勻5 s，靜置10 min取上層液在冷凍離心機中于 4 ℃、1000 r/min離心 10 min，取離心后的上層液置于50 mL離心管中，貼好標簽后置于-80 ℃冰箱保存。

腸道微生物的定植：在SHIME系統(tǒng)模型的升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸中分別加入540 mL、864 mL、540 mL的食物營養(yǎng)液及60 mL、96 mL、60 mL的糞便接種液，在 37 ℃恒溫水浴、磁力攪拌器攪拌下厭氧培養(yǎng)36 h，并用鹽酸（0.05 mol/L）和氫氧化鈉（0.1 mol/L）將升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸模擬罐的pH值分別保持在 5.5～6.0，6.0～6.4，6.5～6.9之間。培養(yǎng)期間每6 h，通氮氣10 min，保證定植過程的厭氧環(huán)境。

SHIME系統(tǒng)模擬消化步驟：定植成功后，模擬東方人進食習(xí)慣分別在每天9:00、15:00、21:00進料，每次加入食物營養(yǎng)液的量為260 mL（干預(yù)期時為早上9:00進食以140 mL混合營養(yǎng)液與120 mL的橘皮湯共260 mL混合后再加入），進料完畢后立即泵入10 mL左右胃液，使胃模擬罐的pH穩(wěn)定于2.0～2.3之間。料液和胃液混合并在胃模擬罐中反應(yīng)2 h后全部泵入小腸模擬罐，同時開啟控制胰液蠕動泵泵入120 mL胰液，使小腸模擬罐pH保持在6.6～7.0之間，4 h后小腸模擬罐到升結(jié)腸模擬罐的蠕動泵開啟，料液全部泵入升結(jié)腸模擬罐，用鹽酸（0.05 mol/L）和氫氧化鈉（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)pH在5.5～6.0之間，發(fā)酵6 h后升結(jié)腸模擬罐蠕動泵開啟，泵出400 mL消化液至橫結(jié)腸，用鹽酸（0.05 mol/L）和氫氧化鈉（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)pH在6.0～6.4之間，消化液在橫結(jié)腸發(fā)酵6 h后將其蠕動泵開啟，泵出400 mL消化液至降結(jié)腸，用鹽酸（0.05 mol/L）和氫氧化鈉（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)pH在 6.5～6.9之間，再發(fā)酵6 h后將其蠕動泵開啟，泵出400 mL廢液至廢液桶。每個模擬罐中放入磁力攪拌子，經(jīng)磁力攪拌器驅(qū)動攪拌子旋轉(zhuǎn)來模擬胃腸道的蠕動；每次進食后向模擬罐中通入 10 min氮氣來模擬實現(xiàn)胃腸道中的無氧環(huán)境，氮氣由外部氮氣罐經(jīng)由導(dǎo)管通過密封蓋上的微孔進入胃模擬管，再經(jīng)由降結(jié)腸模擬罐排出廢液的導(dǎo)管排出。

SHIME系統(tǒng)模擬包括三個時期，為腸道菌群定植穩(wěn)定期、橘皮湯干預(yù)期、橘皮湯干預(yù)后的維持期。穩(wěn)定期與維持期每餐進料只有食物營養(yǎng)液，持續(xù)5 d；干預(yù)期每天早上進料含有食物營養(yǎng)液與橘皮湯，中午與晚上喂食只有食物營養(yǎng)液，持續(xù)3 d。

樣品：取穩(wěn)定期、干預(yù)期、維持期最后一天升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸模擬罐消化前后消化液為樣品。

1.3.3 16 S rRNA高通量測序技術(shù)分析消化液樣品中微生物的多樣性

采用Nanodrop對總DNA進行定量，樣品上樣量為5 μL，電泳時間為20 min，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。使用紫外分光光度檢測測得 OD260/OD280（即核酸吸收的最高峰/蛋白吸收的最高峰）在2.0左右，純度符合要求。PCR擴增對樣品DNA的16S rRNA可變區(qū)V3-V4進行PCR擴增，前引物序列為ACTCCTACGGGAGGCAGCA，后引物序列為GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴增成功后，制備測序文庫，基于Illumina Novaseq-PE250平臺對樣品進行高通量測序，PCR擴增及測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 短鏈脂肪酸含量的測定

1.3.4.1 GC分析條件

DB-FATWAX UI（30 m×0.250 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱，載氣為高純氮氣，柱流量1.5 mL/min，升溫程序為[10]：初始溫度 70 ℃，保持 1 min，以15 ℃/min升至160 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min升至210 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，分流比19:1，進樣量0.5 μL。

1.3.4.2 標準品溶液制備

對8個短鏈脂肪酸混合標準溶液的制備，精密稱量乙酸20.9 mg、丙酸19.9 mg、異丁酸9.5 mg、丁酸10.1 mg、異戊酸9.2 mg、戊酸10.0 mg、己酸9.3 mg、2-乙基丁酸9.6 mg，并用1%甲酸水定容至10 mL，制成混合標準品母液，將母液稀釋1、2、5、10、100、500、100倍后過0.45 μm水膜，置4 ℃冰箱存放備用。

1.3.4.3 樣品溶液制備

取2 mL消化液至離心管中，加入1%甲酸水[14]，渦混儀上混勻30 s，加入1 μL內(nèi)標（2-乙基丁酸），混勻，再以8000 r/min離心10 min，移取上清液過0.45 μm水膜進行氣相色譜分析。

1.3.4.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 測序數(shù)據(jù)和聚類分析

細菌 16S rDNA高通量測序得到有效序列量有1370867條，高質(zhì)量序列量有1029466條。在97%相似度標準下聚類分析，共得到7334個OTU，其相對應(yīng)的OTU數(shù)目見圖1。結(jié)果顯示在升結(jié)腸與橫結(jié)腸中穩(wěn)定期的OTU數(shù)目最多分別為475和1012，在降結(jié)腸中干預(yù)期的OTU數(shù)目最多為1262，說明在升結(jié)腸與橫結(jié)腸中穩(wěn)定期腸道菌群的種類更豐富，在降結(jié)腸中干預(yù)期腸道菌群的種類更豐富，經(jīng)過橘皮湯干預(yù)后腸道菌群種類有所減少。

為進一步比較樣本間的物種組成差異，實現(xiàn)對各樣本的物種豐度分布趨勢的展示，使用熱圖進行物種組成分析。結(jié)果如圖2所示，巨單胞菌屬（Megamonas）在維持期升結(jié)腸豐度最高，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）在穩(wěn)定期升結(jié)腸豐度最高，不動桿菌屬（Acinetobacter）在維持期橫結(jié)腸豐度最高，擬桿菌屬（Bacteroides）穩(wěn)定期降結(jié)腸豐度最高，韋榮氏球菌屬（Veillonella）在穩(wěn)定期升結(jié)腸豐度最高，克雷伯菌屬（Klebsiella）在穩(wěn)定期降結(jié)腸豐度最高，薩特氏菌屬（Sutterella）在干預(yù)期升結(jié)腸豐度最高，代爾夫特菌屬（Delftia）在維持期降結(jié)腸豐度最高。經(jīng)橘皮湯干預(yù)后巨單胞菌屬、不動桿菌屬、薩特氏菌屬及代爾夫特菌屬等菌屬豐度升高，擬桿菌屬、韋榮氏球菌屬及克雷伯菌屬等菌屬豐度降低。

圖1 OTU分布韋恩圖Fig.1 Venn diagram showing the distribution of OTU

圖2 物種聚類的屬水平物種組成熱圖Fig.2 Species composition thermogram at genus level based on species clustering

表1 微生物區(qū)系屬水平相對豐度（%）分布Table 1 Relative abundance (%) distribution of microflora at genus level

2.2 消化液樣品中的細菌物種鑒定及菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平物種組成柱狀圖如圖3所示。優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）及放線菌門（Actinobacteria）。經(jīng)橘皮湯干預(yù)后，厚壁菌門的相對豐度增加，放線菌門的相對豐度減少。

屬水平分布如表1所示，三個時期不同結(jié)腸菌群的差異較大。經(jīng)橘皮湯干預(yù)后，巨單胞菌屬相對豐度在干預(yù)期升高了27.5%、在維持期升高了62.61%；韋榮氏球菌屬相對豐度在干預(yù)期下降了33.65%、在維持期下降了92.78%，克雷伯菌屬相對豐度在干預(yù)期下降了63.60%、在維持期下降了67.82%；雙歧桿菌屬在維持期下降明顯，大腸-志賀氏桿菌屬（Escherichia-Shigella）在干預(yù)期明顯下降，Bacteroides擬桿菌屬在維持期明顯下降，不動桿菌屬在維持期顯著上升。

屬水平物種組成柱狀圖如圖4所示。升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸共有的菌屬有巨單胞菌屬、雙歧桿菌屬、大腸-志賀氏桿菌屬、韋榮氏球菌屬、不動桿菌屬、薩特氏菌屬、克雷伯菌屬及擬桿菌屬?？傮w來說放線菌門的雙歧桿菌屬和厚壁菌門中的巨單胞菌屬在相對豐度上占優(yōu)勢。

圖3 門水平物種組成柱狀圖Fig.3 Histogram of species composition at phylum level

圖4 屬水平物種組成柱狀圖Fig.4 Histogram of species composition at genus level

2.3 Alpha多樣性分析

圖5 穩(wěn)定期、干預(yù)期和維持期的豐度等級曲線圖Fig.5 The curve of abundance grade in stable, treatment and maintenance period

豐度等級曲線可用來反應(yīng)物種豐度、多樣性及均勻度。在水平方向上，曲線的寬度反映物種的豐度，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。三個時期的豐度等級曲線如圖5所示，穩(wěn)定期折線較陡峭，豐度差異較大，均勻度較低；干預(yù)期折線的平緩程度較好，群落中各ASV/OTU間的豐度差異較小，群落組成的均勻度較高；維持期的升結(jié)腸和橫結(jié)腸的曲線寬度最寬，物種豐度最高。

2.4 Beta多樣性分析

圖6 距離矩陣的Bray-Curtis distance指數(shù)UPGMA聚類樹Fig.6 Bray Curtis distance index UPGMA clustering tree of distance matrix

數(shù)據(jù)以樣本距離矩陣的Bray-Curtis distance指數(shù)采用加權(quán)的計算方法，通過計算兩個樣本間各物種豐度差值的絕對值之和與其總豐度的比值，得到UPGMA聚類樹。樣本根據(jù)彼此之間的相似度聚類，樣本間的分枝長度越短，兩樣本越相似。結(jié)果如圖6所示，在三個時期中均是橫結(jié)腸與降結(jié)腸相似度較高，與升結(jié)腸相似度低，這可能是因為食物營養(yǎng)液首先進入升結(jié)腸，再進入橫結(jié)腸與降結(jié)腸，而進入橫結(jié)腸與降結(jié)腸的是升結(jié)腸的發(fā)酵產(chǎn)物。三個時期相比差距較大，原因是穩(wěn)定期只有食物營養(yǎng)液在系統(tǒng)中發(fā)酵，干預(yù)期中在食物營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入了橘皮湯，維持期雖然恢復(fù)了食物營養(yǎng)液繼續(xù)發(fā)酵，但卻是在干預(yù)期橘皮湯干預(yù)改變的菌群中繼續(xù)發(fā)酵。

2.5 短鏈脂肪酸GC圖譜分析

2.5.1 短鏈脂肪酸的標樣色譜圖

圖7 短鏈脂肪酸混合標準品GC圖Fig.7 GC graph of SFACs standard

圖7為 8個標準品的 GC圖，由圖可知，采用DB-FATWAX UI（30 m×0.250 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱，以甲酸作為吸附占據(jù)劑可同時分離 8種SCFAs，且分離效果較好。

2.5.2 消化液中短鏈脂肪酸色譜圖

圖8 消化液樣品中短鏈脂肪酸GC圖Fig.8 GC of SFACs in digestive juice samples

圖8是SHIME系統(tǒng)中消化液樣品短鏈脂肪酸GC圖，由圖可見在本研究氣相色譜條件下，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、2-乙基丁酸（內(nèi)標）可以依次得到分離，且峰形較好；其中乙酸、丙酸含量較多，丁酸次之；己酸未檢測出。

2.5.3 短鏈脂肪酸的含量分析

圖9 橘皮湯對短鏈脂肪酸的影響Fig.9 Effect of orange peel soup on SCFAs

橘皮湯干預(yù)后對短鏈脂肪酸的影響如圖9所示。橘皮湯干預(yù)與穩(wěn)定期對照比較時乙酸在升結(jié)腸階段變化不明顯，在橫結(jié)腸階段顯著減少，在降結(jié)腸階段顯著增多，總體增加了3.21%；丙酸在升結(jié)腸、橫結(jié)腸與降結(jié)腸階段顯著減少了45.43% (p＜0.01)；異丁酸、丁酸和異戊酸在升結(jié)腸、橫結(jié)腸與降結(jié)腸階段顯著增多 (p＜0.01)，分別增加 52.94%、40.86%和 48.94%；戊酸在升結(jié)腸發(fā)酵6 h無顯著變化，在橫結(jié)腸與進入降結(jié)腸顯著增多了80.00%。說明橘皮湯干預(yù)后改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)及豐度的變化，相對應(yīng)的改變了其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸含量。

2.6 討論

腸道菌群作為人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，與宿主共生，保持動態(tài)平衡，維持正常的生理過程。其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸，是腸道上皮細胞的主要能量來源且能夠維持腸道的酸性環(huán)境，促進腸上皮細胞的生長與分化，抑制病原微生物的生長。在本研究中橘皮湯干預(yù)使腸道菌群代謝產(chǎn)物乙酸含量先下降后上升，丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的含量上升，丙酸的含量下降。乙酸是多數(shù)細菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物，也是膽固醇合成的最主要底物，在機體內(nèi)，大部分乙酸被吸收入血液，進入肝臟的代謝，作為周邊組織的能源。乙酸的含量在干預(yù)期降結(jié)腸中升高，可能是由于在橘皮湯干預(yù)期降結(jié)腸菌群多樣性與豐度上升的緣故。丙酸是擬桿菌門發(fā)酵的主要產(chǎn)物，橘皮湯干預(yù)后擬桿菌屬豐度降低，從而使丙酸含量降低，也有研究發(fā)現(xiàn)丙酸主要與克雷伯氏菌呈正相關(guān)[15]，在本研究中橘皮湯也抑制了克雷伯氏菌屬的生長。丁酸主要由厚壁菌門代謝形成，能被結(jié)腸上皮細胞吸收利用，是結(jié)腸、盲腸能量的首選來源[16]，厚壁菌門的巨單胞菌屬在該菌群中屬于優(yōu)勢菌種，且經(jīng)過橘皮湯干預(yù)后巨單胞菌屬豐度上升。也有研究發(fā)現(xiàn)丁酸和變形菌門呈顯著性負相關(guān)[17]，本研究結(jié)果也顯示變形菌門的克雷伯氏菌屬豐度下降。短鏈脂肪酸的生成和消耗是個動態(tài)過程，可以推測橘皮湯干預(yù)后，影響了能發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群，使其豐度發(fā)生變化。而以某種短鏈脂肪酸為能量來源的菌群增多會使短鏈脂肪酸減少。與穩(wěn)定期相比干預(yù)期的物種屬水平相對豐度提高的有巨單胞菌屬、擬桿菌屬，異丁酸、異戊酸及戊酸含量的提高可能與這些菌屬相關(guān)，還可能與韋榮氏菌屬、克雷伯氏菌屬、大腸-志賀氏桿菌屬等有害菌的減少有關(guān)，但主要由哪些菌群代謝形成還有待研究。

中藥在腸道內(nèi)可以發(fā)揮“扶正祛邪的作用”，即促進有益菌的生長，抑制有害菌的生長。有研究證明補益類中藥黨參能夠促進益生菌的生長和繁殖，口服黨參，機體腸道內(nèi)乳桿菌明顯增加，有害大腸桿菌明顯降低[18]。龍承星[19]建立小鼠腸道菌群腹瀉型模型中放線菌門顯著增加，厚壁菌門顯著降低，經(jīng)七味白術(shù)散治療后放線菌門比例下降，厚壁菌門比例上升且高于正常組。本研究結(jié)果顯示橘皮湯能增加厚壁菌門的相對豐度，減少放線菌門的相對豐度。

腸道菌群失調(diào)常導(dǎo)致腹瀉或慢性腹瀉，若腹瀉嚴重則出現(xiàn)惡心、嘔吐癥狀。腹瀉患者常服用雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊、乳酸菌素片及乳酸菌膠囊等。乳酸菌是發(fā)酵糖類及可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸，抑制腸道內(nèi)腐敗細菌的繁殖，調(diào)整腸道菌群，改善腸道運動功能，進而起到治療腹瀉的作用。而巨單胞菌屬亦是利用各種碳水化合物產(chǎn)生乙酸、丙酸和乳酸[20]，丁酸也是由厚壁菌門代謝形成，橘皮湯干預(yù)后巨單胞菌屬在維持期豐度大幅增長，這可能與乳酸菌治療腹瀉的功能類似且與丁酸含量升高有關(guān)?？死撞暇鷮俚姆窝卓死撞暇龆嗫梢鸱窝?、腦膜炎、呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、腹膜炎、腹瀉及敗血癥等。橘皮湯干預(yù)后有害菌克雷伯氏菌屬豐度下降，這可能也是橘皮湯能抑制腹瀉的可能性之一。因此橘皮湯可能是通過促進厚壁菌門巨單胞菌屬生長從而增加乙酸與丁酸含量，且抑制變形菌門克雷伯氏菌屬來達到治療腹瀉的作用?？偟膩碚f橘皮湯的作用機制與腸道微環(huán)境的改變及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的改變密切相關(guān)。

本研究使用的糞便樣品來自過去半年未使用抗生素藥物的健康宿主，對于特定群體如高脂患者、糖尿病患者、過敏人群在橘皮湯干預(yù)后腸道菌群及短鏈脂肪酸的變化還尚待探究。

3 結(jié)論

橘皮湯干預(yù)能起到改變腸道微生物多樣性的功效，并具有調(diào)整菌群豐度水平的作用，表現(xiàn)出促進厚壁菌門巨單胞菌屬生長水平，抑制變形菌門克雷伯菌屬及韋榮氏球菌屬等腸道有害微生物的生長，對放線菌門雙歧桿菌屬也有一定的抑制作用；并對腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有一定的促進作用，在一定程度上改善了人體腸道健康。短鏈脂肪酸的含量也在一定程度上反映了細菌的活性及菌群的數(shù)量。為橘皮湯治療嘔吐、呃逆、噯氣及其藥食同源中藥食材功能開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。