牛佳瑋，莫玲，2，王子锃，李晶晶

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541004）（2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

衰老是不可逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)過程。衰老伴隨的組織器官漸進(jìn)性功能衰退，是各種慢性疾?。ㄈ缣悄虿?、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和癌癥）的關(guān)鍵誘因[1]。中國是老年人口數(shù)量最多、老齡化速度最快的國家，到2050年我國60歲以上人口預(yù)計將增至4.8億[2]。老齡化趨勢加速將極大提高醫(yī)療保健成本，增加社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這已成為了中國目前最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。衰老的發(fā)生不可抗拒，但可以通過運(yùn)動、飲食和藥物干預(yù)延緩衰老的進(jìn)程，其中飲食可能是對健康衰老和延長壽命有重要影響的因素之一[3-5]。

廣西恭城瑤族自治縣是中國長壽之鄉(xiāng)，恭城油茶是世代居住在山區(qū)的瑤族人民為了適應(yīng)山地潮濕和霧瘴的自然生態(tài)環(huán)境而發(fā)明的特色飲食，具有健脾消食和祛寒濕的功效[6]。恭城油茶（Gongcheng oil tea）由茶葉、姜、蔥須（或蒜）、花生和油等原輔料，經(jīng)過反復(fù)錘輾，加水煮沸而制成，“恭城油茶制作技藝”已被列入非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄。已有研究表明，恭城油茶富含茶多酚、姜酚、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有抗氧化、降脂護(hù)肝、調(diào)節(jié)糖脂代謝等保健功效[7-10]。大量的人群研究表明，飲茶可以有效預(yù)防衰老相關(guān)的疾病，如糖尿病[11,12]，心血管疾病[13,14]、阿爾茨海默病[12]等，促進(jìn)人類健康衰老[15]。多酚類化合物是茶葉的主要活性物質(zhì)，已被證實可以明顯延長多種模型生物的壽命，改善炎癥和氧化應(yīng)激，減輕神經(jīng)變性，增強(qiáng)或維持衰老過程中的組織器官功能，降低與衰老有關(guān)疾病的風(fēng)險[16-19]。方志峰等人[7]的研究發(fā)現(xiàn)恭城油茶中茶多酚含量高達(dá)1200 mg/kg，超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的茶飲料（綠茶）的茶多酚含量（≥500 mg/kg）[20]，其主要活性成分可能是表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG），提示恭城油茶可能具有延緩衰老的作用。然而，目前關(guān)于恭城油茶抗衰老作用的研究鮮有報道。本研究通過建立D-半乳糖致衰老小鼠模型模擬人類衰老時的病理變化，觀察小鼠臟器指數(shù)和肝腎組織的病理學(xué)改變，檢測血清、肝臟和腎臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性以及總抗氧化活力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量的變化，評價恭城油茶對模型小鼠衰老的影響，為有效保護(hù)和合理開發(fā)該地方特色食品和傳統(tǒng)文化資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

方便恭城油茶（主要原料為茶、姜、蔥、茶油和食鹽，批號 20190120），由廣西桂林茶葉科學(xué)研究所提供；D-半乳糖，購于北京索萊寶生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒、GSH-Px試劑盒、T-SOD試劑盒、T-AOC試劑盒、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；SPF級KM（昆明）小鼠40只（14～17 g），購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 儀器與設(shè)備

Biomate3S型紫外可見光分光光度儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；L600臺式低速自動平衡離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LUX型多功能性酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；DW-86L828J型醫(yī)用超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 恭城油茶的制備

方便恭城油茶制作方法（發(fā)明專利CN1095220A）：取毛峰嫩茶300 g，生姜400 g，蔥100 g，混合搗爛，加入100 g精制食鹽，拌勻。把100 mL茶油放入鍋內(nèi)，加熱待油滾開時，將上述茶、姜、蔥、鹽混合物導(dǎo)入鍋內(nèi)炒 13 min，取出放入烘干機(jī)中于100 ℃烘20 min，待含水量至5%時取出，即得到干態(tài)方便油茶。稱取15 g方便油茶，加入200 mL蒸餾水，煮沸后冷卻至室溫，用于灌胃實驗。

1.3.2 動物實驗

將小鼠隨機(jī)分為4組，包括正常組、衰老組、Vc灌胃組（陽性對照組）、恭城油茶灌胃組，每組8只。在SPF級動物房（25±1 ?C，濕度60%，光照12 h）飼養(yǎng)一周后開始建模，每日同一時間段給正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余組注射 D-半乳糖（120 mg/kg），連續(xù)造模4周，每周稱重一次，根據(jù)小鼠體重調(diào)整給藥劑量。第5周開始，正常組除繼續(xù)腹腔注射生理鹽水外，每日按照10 mL/kg劑量灌胃蒸餾水；其余組除繼續(xù)每日腹腔注射D-半乳糖外，衰老模型組每日按照10 mL/kg劑量灌胃蒸餾水，Vc灌胃組和油茶灌胃組每日分別灌胃 10 mL/kg劑量的 Vc（100 mg/kg）和恭城油茶（750 mg/kg），持續(xù)4周，每周稱重一次并按照體重調(diào)節(jié)給藥劑量[21]。

1.3.3 小鼠血清和組織采集

采血前24 h禁食，稱重，乙醚麻醉后立即解剖，腹主動脈采血，立即4 ℃，3000 r/min離心15 min，取上層血清，-80 ℃保存。脫頸處死小鼠后，取出小鼠肝臟和腎臟并稱重，加入4 ℃預(yù)冷生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿，-80 ℃保存待測。

1.3.4 小鼠臟器指數(shù)的測定

根據(jù)下列公式分別計算肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)。

臟器指數(shù)/( g/kg)= 組 織質(zhì)量( g )/ 小鼠體質(zhì)量(kg)

1.3.5 血清和組織中生化指標(biāo)測定

參照試劑盒說明書測定小鼠肝臟、腎臟和血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量。

1.3.6 小鼠肝臟和腎臟組織病理學(xué)觀察

小鼠肝臟和腎臟于10%福爾馬林固定，病理學(xué)檢查由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)學(xué)院病理科完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，測定結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（X±SD）表示，各組間的比較采用單因素方差分析，采用LSD法分析差異顯著性，以p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶對衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

表1 各組小鼠臟器指數(shù)Table 1 Organ indexes of mice in each group (n=8)

機(jī)體衰老時，組織器官重量的變化可以反映組織器官損傷和機(jī)體衰老的程度，肝臟和腎臟是機(jī)體重要的代謝器官，其質(zhì)量的下降會直接影響機(jī)體的代謝能力[22]。由表1可知，與正常組相比，其他組肝臟和腎臟均有不同程度的萎縮現(xiàn)象，衰老組小鼠肝臟和腎臟指數(shù)顯著減少（p＜0.05）。油茶灌胃組肝臟、腎臟指數(shù)與正常組比較雖然有所降低，但與衰老組相比均明顯升高（p＜0.05），肝臟和腎臟指數(shù)提升幅度分別為11.87%和25.38%。說明恭城油茶能在一定程度上緩解D-半乳糖導(dǎo)致的肝臟和腎臟損傷，對衰老小鼠具有保護(hù)作用。

2.2 油茶對衰老小鼠抗氧水平的影響

2.2.1 油茶對衰老小鼠肝臟抗氧化水平的影響

D-半乳糖可誘導(dǎo)衰老模型動物機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生過量自由基，造成細(xì)胞損傷及抗氧化酶活力下降、過氧化產(chǎn)物水平升高，產(chǎn)生各器官功能衰退，與機(jī)體的自然衰老過程相似[23]。由表2可知，與正常組相比，衰老組肝臟中抗氧化酶 GSH-Px和 T-SOD活性及T-AOC活力都顯著降低（p＜0.05），而過氧化物MDA含量顯著升高（p＜0.05），表明衰老模型小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平明顯升高。與衰老組相比，油茶灌胃組肝臟中 GSH-Px、T-SOD和 T-AOC分別升高 62.98%、98.35%和 714.63% （p＜0.05），且 MDA 含量降低了65.42%（p＜0.05）。林仲儀等[9]研究發(fā)現(xiàn)，油茶能提高高脂飲食大鼠肝臟抗氧化酶活性，GSH-Px和SOD分別升高36.39%和26.33%，MDA降低了23.40%。表明油茶能夠提高衰老小鼠肝臟的抗氧化能力，緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對大鼠肝臟造成的損傷。

2.2.2 油茶對衰老小鼠腎臟抗氧化水平的影響

腎臟是機(jī)體內(nèi)重要的組織器官，也是衰老過程中容易受損傷、變化較明顯的器官。與衰老組相比（表3），油茶灌胃組能顯著提高小鼠腎臟中GSH-Px、T-SOD活性及T-AOC活力（p＜0.05），同時顯著降低MDA含量（p＜0.05）。其中GSH-Px和T-SOD活性的增加幅度分別為119.66%和182.81%，T-AOC活力增加了155.88%，MDA降低了74.61%，且油茶灌胃組的抗氧化酶GSH-Px、T-SOD活性顯著高于Vc灌胃組（p＜0.05），同時MDA含量顯著低于Vc灌胃組（p＜0.05）。以上結(jié)果與韓春明[24]研究結(jié)果相似：與D-半乳糖模型組比，茶多酚高、中劑量處理組的SOD和GSH-Px活性明顯升高，MDA含量降低（p＜0.01，p＜0.05）。這表明恭城油茶可通過減輕氧化應(yīng)激保護(hù)衰老小鼠腎臟的健康，且效果優(yōu)于對照藥劑Vc。

2.2.3 油茶對衰老小鼠血清抗氧化水平的影響

由表4可見，與衰老組相比，油茶灌胃組血清中GSH-Px、T-SOD活性和 T-AOC活力都顯著升高（p＜0.05），MDA含量顯著降低（p＜0.05）。油茶灌胃組的抗氧化酶GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC活力比衰老組提高了133.72%、63.15%和43.21%，同時MDA含量比衰老組降低了44.09%。上述研究結(jié)果與林仲儀等[9]研究中血清指標(biāo)結(jié)果相似：與高脂模型組相比，油茶低、中和高劑量組 SOD活力的增加幅度分別為24.22%、27.39%和40.85%；GSH-Px活力的增加幅度分別為5.56%、16.02%和27.44%；MDA含量的降低幅度分別為8.51%、14.70%和21.39%。說明油茶具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化水平和抗脂質(zhì)過氧化作用。

表2 小鼠肝臟中GSH-Px和T-SOD酶活性以及T-AOC和MDA水平Table 2 The enzyme activities of GSH-Px and T-SOD, the levels of T-AOC and MDA in liver of mice (n=8)

表3 小鼠腎臟中GSH-Px和T-SOD酶活性以及T-AOC和MDA水平Table 3 The enzyme activities of GSH-Px and T-SOD, the levels of T-AOC and MDA in kidney of mice (n=8)

表4 衰老小鼠血清中GSH-Px和T-SOD酶活性以及T-AOC和MDA水平Table 4 The enzyme activities of GSH-Px and T-SOD, the levels of T-AOC and MDA in serum of mice (n=8)

2.3 衰老小鼠肝臟、腎臟組織病理學(xué)觀察

2.3.1 小鼠肝臟組織切片觀察

圖1 小鼠肝臟組織病理切片圖（×20）Fig.1 Histopathological images of mice liver

D-半乳糖可致衰老模型小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不規(guī)整，肝細(xì)胞排列紊亂，脂肪樣變性較廣泛，胞質(zhì)可見見明顯疏松、腫脹[25]。HE染色結(jié)果表明（圖1），油茶能夠明顯改善衰老小鼠肝細(xì)胞形態(tài)，減少肝細(xì)胞脂肪變性，保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激損傷。正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小、染色均一，肝血竇結(jié)構(gòu)正常（圖1a）；衰老組小鼠肝臟細(xì)胞排列雜亂不均，肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，界限不清，胞漿內(nèi)可見大小不一的脂肪樣變性空泡，肝血竇擴(kuò)張明顯（圖1b）；Vc組小鼠肝臟細(xì)胞索排列基本有序，形態(tài)略有變化，肝細(xì)胞病變程度減輕，細(xì)胞內(nèi)脂肪樣變性空泡減少（圖1c）；油茶組肝臟組織形態(tài)與正常組較相近，肝臟細(xì)胞完整趨于正常，肝細(xì)胞大小和結(jié)構(gòu)未見明顯異常（圖1d）。該研究結(jié)果與林仲儀等[9]報道的，油茶能夠緩解高脂飲食大鼠肝臟脂肪變性，減輕肝細(xì)胞損傷的發(fā)現(xiàn)一致。

2.3.2 小鼠腎臟組織切片觀察

腎臟衰老是一個慢性進(jìn)行性過程，主要涉及到腎小球、腎小管和腎間質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的改變。腎小球基底膜增厚、系膜增生、腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化是腎臟衰老的主要組織學(xué)特征[26]。如圖2所示，正常組小鼠腎小球類圓形且規(guī)整，邊緣明顯，其細(xì)胞排列較規(guī)整，細(xì)胞核顏色較深，腎小管排列整齊，管腔正常（圖2a）；衰老組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)異常萎縮，間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管細(xì)胞水腫明顯，彌漫性空泡樣變（圖2b）；Vc組腎小球類圓形，腎小管及管腔可辨，仍可見間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管細(xì)胞水腫，少量空泡樣變（圖2c）；油茶灌胃組腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，腎小管管腔清晰可辨，空泡性病變程度較低，與正常組最接近（圖2d）。腎臟組織病理切片結(jié)果表明，油茶能明顯改善腎小管水腫及空泡樣變，對D-半乳糖所致的腎臟損傷有保護(hù)作用。

圖2 小鼠腎臟組織病理切片圖（×20）Fig.2 Histopathological images of mice kidney

D-半乳糖衰老模型因全面影響細(xì)胞的代謝功能和一些重要酶的功能，所導(dǎo)致的老化較全面，是一種較為理想的衰老模型[23]。其機(jī)制為D-半乳糖在醛糖還原酶催化下還原成為半乳糖，堆積在細(xì)胞內(nèi)形成高滲透壓；D-半乳糖經(jīng)氧化酶氧化分解為CO2和木酮糖，同時伴有O2和過氧化氫的產(chǎn)生，大量的自由基與體內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應(yīng)，并破壞或消耗機(jī)體抗氧化物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞和組織受損，加速細(xì)胞衰老和死亡[27]。體內(nèi)自由基積累過多，超出機(jī)體調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致自由基鏈鎖反應(yīng)誘發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，生成過氧化脂質(zhì)，并不斷產(chǎn)生自由基，就易引起的一系列與氧化應(yīng)激相關(guān)的病理生理學(xué)變化，肝臟、腎臟和腦組織為主要受累器官。本實驗研究結(jié)果與林仲儀等[9]研究結(jié)果表明，恭城油茶能增強(qiáng)機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力，緩解肝臟和腎臟脂肪變性，對肝臟和腎臟的損傷起到有效的保護(hù)作用；褚廣翠等[8]發(fā)現(xiàn)恭城油茶可以顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)果蠅的氧化損傷，延長果蠅壽命。然而，恭城油茶抗衰老作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究與探索。

3 結(jié)論

與正常組相比，D-半乳糖致衰老組小鼠血清、肝臟和腎臟中氧化水平升高，抗氧化水平明顯降低；衰老組小鼠肝臟和腎臟指數(shù)顯著下降，且出現(xiàn)明顯的脂肪樣變性。恭城油茶干預(yù)后，能明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠肝臟和腎臟指數(shù)的下降；顯著提高衰老小鼠血清、肝臟和腎臟組織中抗氧化酶 GSH-Px、T-SOD活性和總抗氧化能力（T-AOC），降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量；肝臟和腎臟組織病理切片結(jié)果表明，恭城油茶能改善衰老小鼠肝臟、腎臟脂肪樣變性，對衰老小鼠肝臟和腎臟的損傷有一定的保護(hù)作用。恭城油茶對D-半乳糖所致小鼠衰老有明顯的改善作用，而這種作用可能是通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和抑制氧化應(yīng)激引起的器官損傷而發(fā)生的。上述研究結(jié)果為該地方特色食品在延緩衰老和預(yù)防衰老相關(guān)疾病方面的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗室依據(jù)。