白雪松，劉鶴，宋巖，律廣富，林賀，林喆，李銀清

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117）（2.長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院，吉林長春 130117）（3.長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117）

當(dāng)歸（Angelica sinensis）在中國已被用作治療營養(yǎng)不良和貧血的草藥2000多年，在歐洲和美洲也被用作營養(yǎng)劑[1]和功能性食品[2]。由于其治療婦科疾病的優(yōu)勢，被稱為“女性人參”[3]。關(guān)于當(dāng)歸等 6種新增按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)公告（2019年第8號）也有抗血栓及改變血液流變學(xué)、對心血管系統(tǒng)、利膽保肝、潤腸通便、增強(qiáng)免疫等功效[4]，主要含有多糖類成分[5]。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化飛速發(fā)展，超微粉碎技術(shù)成為改善傳統(tǒng)中藥飲片應(yīng)用的重要途徑[6]。中藥材被加工成中藥超微粉飲片，即可以作為功能保健食品，又可以作為藥用，能有效提高中藥材中有效成分溶出和吸收[7]。

現(xiàn)代中藥是傳統(tǒng)現(xiàn)代制藥技術(shù)和中醫(yī)藥理論的結(jié)合產(chǎn)物，是祖國的中醫(yī)藥走出國門和走向世界的載體，中藥超微粉作為藥品和食品，其應(yīng)具有安全、有效、質(zhì)量一致的基本屬性[8]。藥物和保健食品安全性評價(jià)是其應(yīng)用的首要步驟，是應(yīng)用和獲得批準(zhǔn)上市前的必要程序和重要步驟[9]。國家藥監(jiān)部門始終沒有準(zhǔn)許中藥粉末藥材進(jìn)入市場，主要為安全性和臨床用量的有效性。分析中藥材的安全性主要包括四個方面，一是中藥材毒性是客觀存在的，經(jīng)過超微粉碎后，細(xì)胞壁被打破，有效成分溶出速率提高的同時(shí)，也增加了中藥本身包含的內(nèi)源性毒性物質(zhì)的釋放[10]。二是細(xì)胞壁打破造成的潛在特殊成分的釋放和利用，形成新的毒性或引起不良反應(yīng)[11]。三是由于超微粉顆粒具有表面效應(yīng)等，使其對物質(zhì)的吸附性較大，中藥對腸壁的黏附作用增強(qiáng)，使中藥粉粒增加了在腸內(nèi)的停留時(shí)間，可能會造成腸道的物理損傷[12]。四是其釋放的內(nèi)源性物質(zhì)，可能會引起腸道菌群的失衡[13]。

本研究通過藥理學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)，觀察比較當(dāng)歸超微粉飲片、其粗粉飲片和傳統(tǒng)飲片對小鼠胃腸道組織的影響，對當(dāng)歸超微粉的安全性提供科學(xué)依據(jù)?；?16s RNA測序技術(shù)探討當(dāng)歸超微粉對腸道菌群多樣性及物種組成的影響，重點(diǎn)分析了不同濃度當(dāng)歸超微粉對腸道益生菌、潛在有害菌的促進(jìn)或抑制作用，從而選擇出調(diào)節(jié)腸道菌群的最佳濃度，為當(dāng)歸超微粉安全應(yīng)用的劑量問題打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

當(dāng)歸超微粉飲片、原藥材及傳統(tǒng)粗粉由東方紅（通化）生物醫(yī)藥有限公司提供，長春中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為傘形科植物當(dāng)歸（Angelica sinensis(Oliv.) Diels）的干燥根。當(dāng)歸超微粉制備方法為選取傘形科植物當(dāng)歸的根部。春季采挖，除去根須和泥沙，待水分稍蒸發(fā)后，困成小把，上棚，用煙火慢慢熏干，切成片狀，制成的當(dāng)歸飲片。取當(dāng)歸飲片，洗凈，干燥滅菌，粉碎成細(xì)粉；將細(xì)粉進(jìn)行低溫超微粉碎得破壁粉體，混勻，即得。雄性C57BL/6小鼠，8周齡，18～22 g，生產(chǎn)許可證號為 SCXK(吉)-2015-0005，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司。動物飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，日光燈照明，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

切片石蠟，北京索萊寶科技有限公司；Power Soil DNA分離試劑盒，Mo Bio Laboratories公司；RNeasy mini試劑盒，美國Qiagen公司；Trizol，美國Invitrogen公司；Quant-iT?dsDNA HS試劑盒，美國 Thermo Fisher Scientific公司；二甲苯、無水乙醇，北京化工廠；切片石蠟60～62 ℃、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

分析天平（CP12 4S），德國Sartorius公司；Sorvall Evolotion RC型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；D-1320型無菌操作臺，東聯(lián)哈爾儀器制造廠；精密電子天平，美國雙杰兄弟有限公司；光學(xué)顯微鏡（BX 50），日本 Olympus公司；石蠟切片機(jī)，德國 Leica公司；DW-86L490J型-80 ℃超低溫冰箱，青島海爾集團(tuán)；BT-2001激光粒度分布析儀，丹東百特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粒度的測試

采用光散射法-激光粒度分布儀測定超微粉粒度[14]，首先清洗粒度測試儀，使用標(biāo)準(zhǔn)粒子校正儀器。再次清洗儀器后，加入蒸餾水作為混懸介質(zhì)，打開超聲，使用藥匙緩緩加入超微粉飲片，使其遮光率在15.00左右，停止加入。保存測試結(jié)果。讀取D90值，測試十批當(dāng)歸超微粉飲片樣品的粒度，計(jì)算其平均值。

1.3.2 動物分組與藥物的配制

雄性C57BL/6小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為當(dāng)歸超微飲片高劑量組（2.0 g/kg），DA；中劑量組（1.0 g/kg），DB；低劑量組（0.5 g/kg），DC；傳統(tǒng)飲片組（2.0 g/kg），DY；和傳統(tǒng)粉末組（2.0 g/kg），DF；空白組，K。當(dāng)歸藥典規(guī)定的臨床常用劑量為2.0 g/kg，中劑量和和低劑量為臨床常用量逐級減半而來?？瞻捉M給溫開水，傳統(tǒng)飲片采用煎煮法，粗粉組和超微粉組為開水沖泡，混勻給藥，連續(xù)給15 d，每天一次，給藥體積是 20 mL/kg。在同一時(shí)間對小鼠體質(zhì)量測量。

于實(shí)驗(yàn)的第15 d每組隨機(jī)選取5只小鼠，乙醚麻醉后，75%的乙醇溶液給小鼠腹部消毒，在超凈環(huán)境解剖，取位于結(jié)腸處的內(nèi)容物，放置無菌EP管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 胃腸組織病理學(xué)檢查及腸道微生物多樣性檢測

取上述胃腸道組織，進(jìn)行病理切片，HE染色后觀察胃腸道的病理變化。取上述腸道內(nèi)容物，根據(jù)說明書，使用Power Soil DNA分離試劑盒從樣品中提取總DNA。分光光度計(jì)用260 nm的波長測定DNA的濃度和純度?？傮w積為20 μL的PCR擴(kuò)增，使用10 μL KOD FX Neo 緩沖液和 0.4 μL KOD FX Neo 以及4 μL dNTP，每種引物(10 μM)和 50 ng DNA 為 1 μL。使用27正向引物 5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3"和1492反向引物5"-GGTTACCTTGTTACGACTT-3"，通過PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)（95 ℃持續(xù)5 min，然后進(jìn)行30個循環(huán)，然后分別是95 ℃持續(xù)30 s，55 ℃持續(xù) 30 s，72 ℃持續(xù) 1 min/1 kb，并在 72 ℃下放置 7 min），純化 PCR產(chǎn)物。所有 PCR產(chǎn)物均用Quant-iT?dsDNA HS試劑進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)庫的選擇，細(xì) 菌 使 用 16S:Silva[15]（ Release132，http://www.arb-silva.de），而真菌使用 ITS:Unite[16]（Release 8.0，https://unite.ut.ee/）。

采用Illumina測序平臺進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析[17]；基于其注釋結(jié)果，可以得到各水平的物種組成信息[18]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，用 IBM SPSS Statistics 20的軟件分析數(shù)據(jù)，單因素因素方差分析組間差異，β多樣性和α多樣性的檢驗(yàn)方法為Bray-Curtis算法，p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒度測試結(jié)果

十批當(dāng)歸超微粉飲片樣品D90測定結(jié)果，粒徑結(jié)果為21.67±0.49 μm。后續(xù)使用的為該粒度下，符合超微粉飲片粒度標(biāo)準(zhǔn)[19]，使用該粒徑的樣品進(jìn)行的動物實(shí)驗(yàn)。

2.2 超微粉飲片對 C57BL/6小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 當(dāng)歸超微粉飲片對小鼠體重的影響Fig.1 Effect of ultrafine powder of Angelica sinensis on body weight of mice

在超微粉顆粒具有表面效應(yīng)等，使其對物質(zhì)的吸附性較大，中藥對腸壁的黏附作用增強(qiáng)，使中藥粉粒增加了在腸內(nèi)的停留時(shí)間，可能會造成腸道的物理損傷。前人研究表明了超微粉有類似的毒性[20]。給藥期間，小鼠的體重變化如圖1所示。各組無明顯差異，且趨于平穩(wěn)，維持在23 g左右，當(dāng)歸超微粉與傳統(tǒng)飲片、傳統(tǒng)粗粉一樣，均對C57BL/6小鼠體質(zhì)量無顯著影響。

2.3 C57BL/6小鼠剖檢與組織病理學(xué)變化

從剖檢后小鼠各組織器官來看，當(dāng)歸給藥后各組均沒有觀察到任何異常和可疑病變。經(jīng)HE病理學(xué)檢查小鼠小腸、胃組織（圖2、3），結(jié)果顯示當(dāng)歸超微粉各組小鼠胃粘膜無變薄、固有層也炎癥浸潤現(xiàn)象、胃部腺體形態(tài)正常；當(dāng)歸超微粉各組小鼠腸道粘膜無明顯病變；腸壁下層沒有顯著炎癥浸潤現(xiàn)象。綜上，口服給藥15 d，當(dāng)歸參超微粉各組均對小鼠胃腸道無肉眼明顯損害，故常用的口服給藥方式對小鼠胃腸道組織沒有明顯的傷害作用?？蔀楫?dāng)歸以超微粉的方式使用的安全性，提供科學(xué)依據(jù)。

圖2 當(dāng)歸超微粉對C57BL/6小鼠胃組織病理學(xué)的影響（×100）Fig.2 Effect of Angelica supermicron powder on histopathology of C57BL/6 mice stomach (×100)

圖3 當(dāng)歸超微粉對C57BL/6小鼠腸組織病理學(xué)的影響（×100）Fig.3 Effect of Angelica supermicron powder on intestinal histopathology in C57BL/6 mice (×100)

圖4 C57BL/6小鼠腸道菌群PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR products of intestinal microflora in C57BL/6 mice

2.4 腸道微生物多樣性分析

2.4.1 小鼠腸道內(nèi)容物

超微粉碎后的藥材，釋放的內(nèi)源性物質(zhì)，可能會引起腸道菌群的失衡[21]，故以小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。各處理組每組取5只小鼠腸道內(nèi)容物基因組提取，圖4為PCR擴(kuò)增結(jié)果，分為第一次擴(kuò)增和第二次復(fù)檢。擴(kuò)增條帶大小為465 bp，擴(kuò)增后產(chǎn)物條帶位置正確和清晰明亮，樣品的質(zhì)量全部達(dá)到了我們后續(xù)建庫和測序的要求。

2.4.2Alpha多樣性分析

Alpha多樣性（Alphadiversity）反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性。有Chao1、Ace、Shannon以及Simpson四種衡量指標(biāo)。Chao1和Ace指數(shù)評價(jià)物種數(shù)量的多少。Shannon及Simpson指數(shù)評價(jià)物種多樣性。相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有較大的均勻度，認(rèn)為群落具有較大的多樣性，Simpson指數(shù)值小，Shannon指數(shù)值大，說明樣品物種多樣性高[22]。統(tǒng)計(jì)OTU覆蓋率（Coverage），發(fā)現(xiàn)其比率均大于99.00%以上，表示樣本中物種被測出的概率高，未被測出的概率低，反映出了測序結(jié)果代表樣本中微生物真實(shí)情況。

稀釋性曲線[23]，從樣本中隨機(jī)抽取一些序列，統(tǒng)計(jì)所抽取序列代表的物種數(shù)目，以序列數(shù)和物種數(shù)構(gòu)建曲線，檢驗(yàn)出測序數(shù)據(jù)量足夠反映出樣品中的物種多樣性，反映樣品中物種的豐富程度（圖5）。

結(jié)果表明，隨著抽取數(shù)量的加大，曲線趨于平緩，表示環(huán)境中的物種并不會隨測序數(shù)量的增加而明顯增加，測序量足夠反映樣品物種多樣性。等級豐度曲線[24]，是將各樣品的 OTU豐度按大小排序并基于其相對豐度繪制的曲線圖，主要用于同時(shí)解釋樣品所含物種的豐富度和均勻度，物種的豐富度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線較寬，表示物種的組成足夠豐富，物種組成的均勻度由曲線的形狀來反映，曲線平坦，表明物種組成的均勻程度高（圖6）。

圖5 C57BL/6小鼠腸道微生物樣品稀釋曲線Fig.5 Multy samples rarefaction curve of intestinal microflora in C57BL/6 mice

圖6 C57BL/6小鼠腸道微生物等級豐度曲線Fig.6 Rank abundance curves of intestinal microflora in C57BL/6 mice

2.4.3Beta多樣性分析

β多樣性主要分析了樣本與樣本間微生物群落組成的相似性。比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。采用加權(quán)的方式，Bray-Curtis算法計(jì)算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值，加權(quán)方法，需要同時(shí)考慮物種有無以及物種豐度兩個問題。

主坐標(biāo)分析法[25]（Principal coordinates analysis，PCoA），是一種與PCA類似的降維排序方法，通過主坐標(biāo)分析可以實(shí)現(xiàn)多個樣品的分類，進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異。在小鼠飼養(yǎng)第15 d時(shí)，空白組主成分分析顯示（圖7），相聚較為緊密組間差異小，和當(dāng)歸給藥組有明顯的分界線；當(dāng)歸超微粉飲片等臨床劑量組，也顯示出明顯調(diào)節(jié)趨勢；此時(shí)當(dāng)歸超微粉起到生物活性作用，對腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，使給藥組組與空白組組區(qū)分顯著。當(dāng)歸傳統(tǒng)飲片給藥，對小鼠腸道菌群有明顯的調(diào)節(jié)趨勢，顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢；中劑量組和低劑量組的當(dāng)歸超微粉介于超微粉等臨床劑量組和傳統(tǒng)飲片之間，應(yīng)為超微粉應(yīng)用重點(diǎn)關(guān)注劑量。粗粉組最為分散，無明顯趨勢。置換多元方差分析，它主要是用于分析多維度數(shù)據(jù)組間相似性的統(tǒng)計(jì)方法?？梢詫Σ煌纸M的樣品之間beta多樣性是否顯著差異進(jìn)行檢驗(yàn)。測試結(jié)果顯示，各處理組，組內(nèi)差異很小，組間差異都不明顯，表明沒有改變菌群的大體結(jié)構(gòu)。

圖7 C57BL/6小鼠腸道微生物主坐標(biāo)分析Fig.7 Principal coordinates analysis of intestinal microflora in C57BL/6 mice

圖8 小鼠腸道微生物置換多元方差分析Fig.8 Permanova analysis of intestinal microflora in C57BL/6 mice

2.4.4 腸道微生物物種分布情況

經(jīng)物種組成分析可得知各處理組在各分類水平上的分類學(xué)比對情況。組間差異顯著性分析，用來發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的腸道菌落。本實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，重點(diǎn)分析了門水平和屬水平的。在物種分布柱狀圖中，一種顏色代表一個腸道菌群的物種，色塊長度代表物種所占相對含量比例。門水平所以物種，屬水平顯示含量前20的物種。并將含量低于前20的微生物合并為Others在圖中顯示，Unclassified為沒有進(jìn)行分類學(xué)注釋的微生物。

2.4.4.1 基于門水平差異性分析

經(jīng)過15 d的各種方式處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（由表1和圖9顯示），當(dāng)歸超微粉飲片高劑量組的疣微菌門（Verrucomicrobia）含量顯著增加（p＜0.05），放線菌門（Actinobacteria）含量減少（p＜0.01）。另外當(dāng)歸超微粉飲片中劑量組擬桿菌門（Bacteroidetes）含量降低最為顯著，厚壁菌門（Firmicutes）增加最為顯著。其中厚壁菌門和擬桿菌門在腸道菌群中占絕對主導(dǎo)地位。腸道菌群和機(jī)體互相影響，互相依賴和共生，口服藥物通過胃腸道，對胃腸道的作用既可以是胃腸道組織，也可以是腸道微生物。在腸道微生物的門水平，高劑量組可調(diào)節(jié)疣微菌門 Verrucomicrobia和Actinobacteria,二者皆為優(yōu)勢菌群[26]。表明了中劑量的當(dāng)歸超微粉對小鼠腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用，可以考慮該劑量進(jìn)行日常保健應(yīng)用或者臨床應(yīng)用，能減少藥材的用量，減少藥物在體內(nèi)蓄積過多而產(chǎn)生的副作用。

圖9 當(dāng)歸超微粉對小鼠腸道菌群門水平物種分布的影響Fig.9 Effects of Angelica superfine powder on the distribution of intestinal phylum level in mice

表1 當(dāng)歸超微粉和空白組門水平差異菌群Table 1 Different flora of Angelica superfine powder and blank group

表2 當(dāng)歸超微粉和空白組屬水平差異菌群Table 2 Different flora of Angelica superfine powder and blank group

2.4.4.2 基于屬水平差異性分析

當(dāng)歸經(jīng)過適度的微粉化能促進(jìn)當(dāng)歸有效成分阿魏酸的溶出速率、累積溶出率和溶出總量[27]。所以臨床用量必須進(jìn)行調(diào)整。臨床用量調(diào)整的依據(jù)可為其傳統(tǒng)療效的強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)腸道菌群的新療效等。為了研究兩組樣品間微生物群落豐度的差異，利用 Metastats[28]軟件對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，重點(diǎn)篩選出等臨床劑量當(dāng)歸超微粉和空白組有差異的菌群結(jié)構(gòu)。為Tyzzerella_3、GCA-900066575、Gordonibacter、Enterorhabdus、Clostridium_sensu_stricto_1、Coriobacteriaceae_UCG-002、Streptococcus以及Faecalibaculum。其中含量排在前 20的為Faecalibaculum，含量增加（p＜0.05），其中中劑量組對小鼠腸道菌群Faecalibaculum增加最明顯，可能高劑量抑制該菌落生長，低濃度有一定的促進(jìn)生長的作用。另外，在對Dubosiella水平的增加有明顯的增加作用，在 other為其他物種合并顯示出有明顯的增加作用。在屬水平高劑量主要調(diào)節(jié)Faecalibaculum，腸道內(nèi)Faecalibaculum可抑制腸道腫瘤生長，無其他不良副作用[29]。另外發(fā)現(xiàn)，中劑量組（1.0 g/kg）對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)較為柔和，推薦該劑量為保健用量。所以，使用中劑量組的超微粉飲片可能最為合適，與在門水平結(jié)果是相似的。

圖10 當(dāng)歸超微粉對小鼠腸道菌群屬水平物種分布的影響Fig.10 Effects of Angelica superfine powder on the distribution of intestinal genus level in mice

3 結(jié)論

當(dāng)歸經(jīng)超微粉碎后，破壁率大大提高，微粉較普通粉粒度分布均勻。另外，溶出試驗(yàn)表明，由于當(dāng)歸超微粉碎后比表面積增大，其成分溶出速度加快，溶出量增加，從而提高了中藥的生物利用度和治療效果。但并不是粒徑越小越好，粒徑越小，粒子表面會更易吸附空氣和帶有電荷，影響有效成分的吸收?；蛘邥鹣鄳?yīng)的毒性。本次研究，以當(dāng)歸超微粉飲片為研究對象，通過藥理學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)和基于 16s RNA測序技術(shù)，考察對C57BL/6小鼠腸道菌群、胃腸道組織的影響，評價(jià)其安全性。為當(dāng)歸超微粉以保健食品或者藥材飲片的方式進(jìn)行應(yīng)用，提供科學(xué)的理論依據(jù)。另外，可以找出當(dāng)歸超微粉口服給藥對小鼠腸道菌群，為今后當(dāng)歸超微粉飲片與腸道菌群相關(guān)的藥效學(xué)研究提供了技術(shù)支持。針對當(dāng)歸超微粉對腸道菌群的研究可以為臨床相關(guān)疾病的研究提供線索，為人類的健康保駕護(hù)航。