袁會軍，蘆 軍，崔志強(qiáng)，韓 鵬

(西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院介入周圍血管科，陜西 西安 710054)

異常的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能受損是促進(jìn)血管內(nèi)血栓形成的重要原因，可誘發(fā)血栓性疾病[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的、長約18～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，是一類重要的基因負(fù)向調(diào)控因子。研究表明，miRNA參與廣泛的病理生理過程，在各種各樣的疾病中均具有重要的作用[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-543在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的促癌作用[6-9]，但其在血管內(nèi)皮氧化損傷中的作用研究報(bào)道較少。因此，本研究通過觀察miR-543對過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human venous endothelial cells，HUVECs)中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和血栓形成相關(guān)因子的影響，初步探索其潛在的調(diào)控機(jī)制，旨在為血管內(nèi)皮氧化損傷的分子機(jī)制研究提供新的依據(jù)，及臨床血栓性疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器HUVECs購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，miR-543 mimic及其陰性對照mimic-NC、miR-543 inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和RNA 提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)試劑盒購自南京凱基生物有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipita-tion assay，RIPA)細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白定量測定試劑購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，抗白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)1、細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)1、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)、組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial type nitric oxide synthase，eNOS)一抗購自美國Abcam公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記兔抗山羊、羅丹明標(biāo)記兔抗山羊購自北京中衫金橋生物有限公司，抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、FITC標(biāo)記小鼠抗兔二抗、FITC標(biāo)記羊抗兔等二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，ABI 7500實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司，多功能電泳儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)購自美國LICOR Bio-science公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HUVECs的體外培養(yǎng)將HUVECs置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時以2.5 g·L-1胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，每2～3 d傳代1次，選用4～8代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HUVECs分組及處理取對數(shù)生長期HUVECs依據(jù)不同處理方法分組。(1)對照組：按每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，不給予其他任何處理。(2)100、200、300、400 μmol·L-1H2O2組：按每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，加入含有H2O2的DMEM，使H2O2終濃度分為100、200、300、400 μmol·L-1，然后滴加到相應(yīng)細(xì)胞孔板，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 h。(3)inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組：按每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，將miR-543 inhibitor和inhibitor-NC通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染到HUVECs中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 h 后，再將終濃度為300 μmol·L-1的H2O2滴加到相應(yīng)細(xì)胞孔板，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 h。(4)mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR組、mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組及mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR組、mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組：通過microRNA.org(http://www.microrna.org/)軟件預(yù)測出TFPI和eNOS的3′-UTR區(qū)域均含有miR-543的結(jié)合位點(diǎn)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增出含有miR-543結(jié)合位點(diǎn)的TFPI 3′-UTR序列和eNOS 3′-UTR序列，將這2段序列分別克隆到pGL3-basic載體中，命名為pGL3-TFPI 3′-UTR載體和pGL3-eNOS 3′-UTR載體。通過基因定點(diǎn)誘變構(gòu)建出pGL3-TFPI 3′-UTR mut載體和pGL3-eNOS 3′-UTR mut載體作為陰性對照。取對數(shù)生長期HUVECs隨機(jī)分為mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR組、mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組，將miR-543 mimic或mimic-NC與pGL3-TFPI 3′-UTR或pGL3-TFPI 3′-UTR mut載體，連同pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的各組細(xì)胞中。取對數(shù)生長期HUVECs隨機(jī)分為mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR組、mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組，將miR-543 mimic或mimic-NC與pGL3-eNOS 3′-UTR或pGL3-eNOS 3′-UTR mut載體，連同pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染到各組細(xì)胞中。(5)mimic-NC組和miR-543 mimic組：按每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，24 h后將mimic-NC和miR-543 mimic通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染到各組HUVECs中。

1.2.3 MTT法檢測HUVECs活性取“1.2.2”對照組及100、200、300、400 μmol·L-1H2O2組HUVECs，每孔加入10 μL MTT試劑(0.5 g·L-1)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，震蕩溶解15 min，使用酶標(biāo)儀檢測 490 nm 波長處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活性，細(xì)胞活性=[1-(對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對照組吸光度值]×100%。另取“1.2.2”中對照組、300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs采用上述方法檢測細(xì)胞活性。

1.2.4 qRT-PCR檢測HUVECs中miR-543相對表達(dá)量取“1.2.2”對照組、300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs，TRIzol試劑提取各組細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR。miR-543引物序列：正向引物序列為5′-CCAGCTACACTGGGCAGCAGCAATTCATGTTT-3′，反向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6作為內(nèi)參，正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 變性 30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用ABI 7500實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)對qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，2-△△Ct法計(jì)算miR-543 的相對表達(dá)量，取均值。

1.2.5 酶標(biāo)儀法檢測HUVECs中SOD、GSH-Px活性及MDA和NO水平取“1.2.2”中對照組、300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs，分別按照SOD、GSH-Px、MDA、NO檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞處理，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值并計(jì)算SOD活性，使用酶標(biāo)儀測定340 nm處吸光度值并計(jì)算GSH-Px活性，使用酶標(biāo)儀測定波長532 nm處吸光度值并計(jì)算MDA水平，使用酶標(biāo)儀測定波長540 nm處吸光度值并計(jì)算NO水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 Western blot法檢測HUVECs中IL-1β、ICAM1、VCAM1、TM、TFPI及eNOS蛋白相對表達(dá)量取“1.2.2”中對照組、300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs，去除培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌1次，然后每孔加入RIPA裂解液與PMSF的混合液(100:1)，裂解細(xì)胞15 min，4 ℃下10 000 r·min-1離心，收集上清液提取總蛋白，根據(jù)試劑盒說明書提取核蛋白，BCA 蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后取20 μg 樣品蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入抗IL-1β、VCAM1、ICAM1、TM、TFPI、eNOS、GAPDH一抗(稀釋度分別為：1:1 000、1:500、1:500、1:500、1:500、1:500、1:1 000)，4 ℃過夜孵育，之后加入FITC或羅丹明標(biāo)記的二抗(稀釋度為1:10 000)，室溫孵育1 h。Tris-HCl-吐溫緩沖鹽溶液洗滌3次后，使用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并分析灰度值，以待測目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測HUVECs中熒光素酶活性取“1.2.2”中mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR組、mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組及mimic-NC + pGL3-eNOS 3′-UTR組、mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組轉(zhuǎn)染48 h后HUVECs，采用雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測各組HUVECs中熒光素酶活性，嚴(yán)格按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.8 對照組、mimic-NC組和miR-543 mimic組HUVECs中 miR-543及TFPI、eNOS蛋白相對表達(dá)量檢測取“1.2.2”中對照組、mimic-NC組和miR-543 mimic組HUVECs，采用qPCR檢測細(xì)胞miR-543相對表達(dá)量，方法同“1.2.4”；采用Western blot檢測細(xì)胞TFPI、eNOS蛋白相對表達(dá)量，方法同“1.2.6”。

2 結(jié)果

2.1 5組HUVECs細(xì)胞活性比較對照組及100、200、300、400 μmol·L-1H2O2組HUVECs細(xì)胞活性分別為：(100.00±13.23)%、(91.25±11.64)%、(75.44±8.41)%、(56.15±6.73)%、(31.74±4.36)%，HUVECs細(xì)胞活性呈濃度依賴性降低(P<0.05)。當(dāng)H2O2濃度為300 μmol·L-1時，細(xì)胞活性約為對照組的50%，該濃度用來誘導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。對照組、300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs細(xì)胞活性分別為(100.00±14.12)%、(54.63±6.25)%、(80.27±9.11)%、(53.57±6.48)%；與對照組比較，300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs細(xì)胞活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；inhibitor+H2O2組HUVECs細(xì)胞活性顯著高于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；300 μmol·L-1H2O2組與inhibitor-NC+H2O2組HUVECs 細(xì)胞活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 4組HUVECs中miR-543相對表達(dá)量比較對照組、300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中miR-543相對表達(dá)量分別為1.00±0.12、3.54±0.42、1.38±0.19、3.83±0.45；與對照組比較，300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中miR-543相對表達(dá)量顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；inhibitor+H2O2組HUVECs中miR-543 相對表達(dá)量顯著低于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；300 μmol·L-1H2O2組與inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中miR-543相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 4組HUVECs中SOD和GSH-Px活性及MDA和NO水平比較結(jié)果見表1。與對照組比較，300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中SOD和GSH-Px活性、NO水平顯著降低，MDA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；inhibitor+H2O2組與對照組HUVECs中SOD和GSH-Px活性、MDA、NO水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；inhibitor+H2O2組HUVECs中SOD和GSH-Px活性、NO水平顯著高于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，MDA水平顯著低于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；300 μmol·L-1H2O2組與inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中SOD和GSH-Px活性、MDA和NO水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 4組細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性、MDA和NO水平比較

2.4 4組HUVECs中IL-1β、ICAM1、VCAM1、TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2和圖1。300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中IL-1β、ICAM1和VCAM1蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。inhibitor+H2O2組HUVECs中IL-1β、ICAM1和VCAM1蛋白相對表達(dá)量顯著低于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量顯著高于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。300 μmol·L-1H2O2組與inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中IL-1β、ICAM1、VCAM1、TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2：300 μmol·L-1 H2O2組；3：inhibitor +H2O2組；4：inhibitor-NC+H2O2組。

表2 4組HUVECs中IL-1β、ICAM1、VCAM1、TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量比較

2.5 3組HUVECs中熒光素酶活性、miR-543相對表達(dá)量及TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表3。mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR組熒光素酶活性分別為1.00±0.11、0.96±0.11、0.98±0.11、0.58±0.07；mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR組熒光素酶活性顯著低于mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組、mimic-NC+pGL3-TFPI 3′-UTR組和miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR組熒光素酶活性分別為1.00±0.11、0.97±0.12、0.98±0.13、0.51±0.07；mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR組、miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR組熒光素酶活性顯著低于mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組、mimic-NC+pGL3-eNOS 3′-UTR組和miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-543 mimic組miR-543相對表達(dá)量顯著高于對照組和mimic-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與mimic-NC組miR-543表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-543 mimic組TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組和mimic-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與mimic-NC組TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2：miR-543 mimic組；3：mimic-NC組。

表3 對照組、miR-543 mimic組、mimic-NC組HUVECs中miR-543及TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

血栓性疾病主要包括急性心肌梗死、腦血栓、動脈血栓和缺血性休克等，因其較高的發(fā)病率及致死率成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞具有促凝和抗凝2種作用。正常情況下，完整的內(nèi)皮細(xì)胞能夠抗凝血、抑制血小板黏附，但當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷或者被激活時，會引起局部凝血，導(dǎo)致血栓形成。因此，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整與否，對血栓發(fā)生起著至關(guān)重要的作用[10]。目前，因HUVECs具有與動脈血管內(nèi)皮相似的生物學(xué)特征，從而成為體外實(shí)驗(yàn)研究的重要對象。本研究通過體外H2O2誘導(dǎo)HUVECs，構(gòu)建體外內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，進(jìn)而探討miR-543在這種細(xì)胞損傷中的表達(dá)和功能。

本研究結(jié)果顯示，300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs細(xì)胞活性顯著低于對照組，miR-543相對表達(dá)量顯著高于對照組；inhibitor+H2O2組HUVECs細(xì)胞活性顯著高于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，miR-543相對表達(dá)量顯著低于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組；說明在H2O2誘導(dǎo)的HUVECs中，miR-543表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞活性顯著降低；而抑制miR-543表達(dá)后，細(xì)胞活性顯著提高，提示miR-543在血管內(nèi)皮氧化損傷中可能發(fā)揮重要的作用。生理情況下，機(jī)體不斷生成亦不斷地清除ROS，使ROS保持穩(wěn)態(tài)。機(jī)體內(nèi)抗氧化酶如SOD、GSH-Px是有效增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的物質(zhì)，MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低可反映自由基水平及細(xì)胞損傷程度，被廣泛作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物[11]。本研究結(jié)果顯示，300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中SOD和GSH-Px活性、NO水平顯著低于對照組，MDA水平顯著高于對照組；inhibitor+H2O2組HUVECs中SOD和GSH-Px活性、NO水平顯著高于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，MDA水平顯著低于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組；這說明抑制miR-543的過表達(dá)能夠阻礙H2O2引起的HUVECs損傷中SOD和GSH-Px活性下降，降低MDA水平，證實(shí)抑制miR-543過表達(dá)能夠抑制H2O2引起的血管內(nèi)皮氧化損傷。血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)是血栓形成過程中的重要一環(huán)，內(nèi)皮細(xì)胞在外界環(huán)境刺激下，能夠誘導(dǎo)多種炎癥因子和黏附分子的產(chǎn)生，加速白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和炎癥反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor+H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中IL-1β、ICAM1和VCAM1相對表達(dá)量顯著升高；inhibitor+H2O2組HUVECs中IL-1β、ICAM1和VCAM1相對表達(dá)量顯著低于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，說明抑制miR-543的過表達(dá)能夠阻礙H2O2引起的HUVECs中IL-1β、ICAM1和VCAM1表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)而抑制H2O2導(dǎo)致的HUVECs的炎癥反應(yīng)。以上研究結(jié)果表明，抑制miR-543過表達(dá)能夠降低H2O2引起內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

在病理過程中，炎癥細(xì)胞過度釋放炎癥介質(zhì)，凝血因子表達(dá)增加，自然的抗凝血作用受到抑制，而凝血因子過度活化又促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致難以控制的血栓形成和炎癥損傷[13]。TM是廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，其通過抑制細(xì)胞增殖、黏附和炎癥反應(yīng)來維持內(nèi)皮微環(huán)境，同時也可激活蛋白C及凝血酶而發(fā)揮抗凝作用[14]。TFPI是一種跨膜單鏈蛋自，高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面，也可被釋放于血漿中，能夠阻斷外源性凝血途徑級聯(lián)反應(yīng)[15]。NO為內(nèi)皮衍生的松弛因子，具有擴(kuò)張血管和抗血小板聚集作用，可發(fā)揮抗凝血、抗氧化、抗炎以及抑制平滑肌細(xì)胞增殖等多種作用[16]。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受氧自由基等損傷時，NO釋放減少，易致血栓形成。本研究結(jié)果顯示，300 μmol·L-1H2O2組、inhibitor + H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組HUVECs中TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量及NO水平顯著低于對照組；inhibitor+H2O2組HUVECs中TM、TFPI和eNOS蛋白相對表達(dá)量及NO水平顯著高于300 μmol·L-1H2O2組和inhibitor-NC+H2O2組，說明抑制miR-543的過表達(dá)能夠阻礙H2O2引起的TM、TFPI、eNOS及NO表達(dá)水平的降低，提示抑制miR-543表達(dá)能夠通過調(diào)控TM、TFPI、eNOS和NO的表達(dá)來阻礙血栓的形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR組熒光素酶活性顯著低于miR-543 mimic+pGL3-TFPI 3′-UTR mut組，miR-543 mimic + pGL3-eNOS 3′-UTR組熒光素酶活性顯著低于miR-543 mimic+pGL3-eNOS 3′-UTR mut組；miR-543 mimic組miR-543相對表達(dá)量顯著高于對照組和mimic-NC組，而miR-543 mimic組TFPI和eNOS相對表達(dá)量顯著低于對照組和mimic-NC組，說明miR-543能夠通過直接靶向TFPI和eNOS的3′-UTR區(qū)域來抑制TFPI和eNOS的表達(dá)。

綜上所述，miR-543在H2O2誘導(dǎo)的HUVECs中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-543表達(dá)能夠降低H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，阻礙H2O2引起的TM、TFPI、eNOS和NO表達(dá)下調(diào)，并且miR-543能夠直接靶向調(diào)控TFPI和eNOS的表達(dá)。本研究可能為研究血管內(nèi)皮氧化損傷的分子機(jī)制提供新的依據(jù)，miR-543可作為臨床防治血栓形成的新靶點(diǎn)。