盧 娜，李 曉，劉冬玲，王現(xiàn)偉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

心血管疾病以發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復(fù)發(fā)率高及經(jīng)濟負擔(dān)高為特點，嚴(yán)重危害人類健康[1]。2020年我國心血管疾病患者約3.30億，心血管疾病已成為重大的公共衛(wèi)生問題[2]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是各種心血管疾病的主要潛在原因，其發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚不清楚。有害刺激可引起細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平失衡，導(dǎo)致線粒體(mitochondrion,MT)氧化損傷，繼而發(fā)生電子傳遞鏈中斷、三磷腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生成障礙、氧化還原系統(tǒng)崩潰、MT蛋白表達異常及線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)損傷等，通過級聯(lián)效應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可通過誘導(dǎo)mtDNA損傷和功能障礙而促進AS的發(fā)生和發(fā)展[4]。本文就ROS的產(chǎn)生、mtDNA損傷與AS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系作一概述，以期為AS的防治提供新的策略和靶點。

1 MT及mtDNA組成與功能

MT被稱為“power house”，是數(shù)量和形態(tài)可變的動態(tài)細胞器，其在細胞質(zhì)內(nèi)游走，并組成一個細胞器群，持續(xù)穩(wěn)定地分裂、融合、更新。MT除產(chǎn)生ATP為細胞提供能量外，其還是細胞生長、分化、凋亡和信息傳遞等生命活動的調(diào)控中心。MT由2層膜包被：光滑的外膜起界膜作用；內(nèi)膜向內(nèi)高度折疊形成MT嵴，MT嵴內(nèi)存在呼吸鏈酶系和ATP酶復(fù)合體等，承擔(dān)諸多的生物化學(xué)反應(yīng)；2層膜之間為MT膜間隙，被內(nèi)膜包裹的是MT基質(zhì)。MT內(nèi)膜及基質(zhì)中含有其所固有的mtDNA、RNA和核糖體，因此，MT具有獨立的遺傳信息復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯功能，但其基因組數(shù)量有限，屬于一種半自主性的細胞器[5]。人類mtDNA是長度為16 569 bp的雙鏈超螺旋閉環(huán)分子，內(nèi)環(huán)為L鏈，外環(huán)為H鏈，均有編碼功能，共含37個基因，但不含組蛋白。mtDNA非編碼區(qū)又稱D-環(huán)，調(diào)控mtDNA轉(zhuǎn)錄的啟動，L鏈和H鏈的啟動子及H鏈的復(fù)制起始點均位于D-環(huán)；其編碼區(qū)無內(nèi)含子，編碼2個核糖體RNA基因、22個轉(zhuǎn)運RNA基因、13個與電子傳遞鏈及氧化磷酸化相關(guān)的多肽[主要有Cyt c氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞基，Cyt bc復(fù)合體Cyt b亞基，ATP酶復(fù)合體6、8亞基及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)脫氫酶的7個亞基]，且L鏈的復(fù)制起始點位于編碼區(qū)；雖然MT有自己的基因組，但調(diào)節(jié)mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的所有蛋白質(zhì)均由細胞核DNA編碼[6]。

2 ROS與mtDNA損傷

2.1 ROS的產(chǎn)生MT是細胞有氧代謝和生成ROS的主要場所。ROS主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(nitric oxide,NO)等。正常生理狀態(tài)下，1%～2%的電子從MT內(nèi)膜電子傳遞鏈中脫離漏出，被還原成O2-和H2O2等，同時ROS可被超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶類及類胡蘿卜素、維生素C、維生素E等抗氧化劑降解，從而維持細胞氧化還原自穩(wěn)態(tài)。正常代謝產(chǎn)生的ROS具有調(diào)節(jié)免疫及發(fā)揮第二信使、消滅有害微生物等獨特的生理作用，是維持組織細胞正常功能及防御所必需的氧自由基[7]。但在病理狀態(tài)下，受損的電子傳遞鏈，特別是電子傳遞復(fù)合物Ⅰ(NADH脫氫酶復(fù)合物)和復(fù)合物Ⅲ(CoQH2-細胞色素C還原酶復(fù)合物)易受攻擊，導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生。O2-是ROS的基本形式，其他類型的ROS可通過O2-的代謝產(chǎn)生。其中O2-與錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,MnSOD)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，H2O2在鐵離子的螯合作用下通過Fenton反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘摹H；O2-還可以與NO反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)[8]。當(dāng)機體受到各種有害刺激時,ROS的生成與抗氧化之間失衡，當(dāng)產(chǎn)生速率大于降解清除速率時，ROS水平顯著增加，在體內(nèi)異常蓄積，造成氧化應(yīng)激[9]。在氧化應(yīng)激中，ROS類物質(zhì)通過“ROS 誘導(dǎo)的 ROS 釋放”(ROS-induced ROS release,RIRR)產(chǎn)生更多的ROS[10]；并能觸發(fā)單個MT通透性轉(zhuǎn)換孔異常開放，使ROS運輸形成正反饋機制，導(dǎo)致ROS累積；堆積的ROS可觸發(fā)MT膜電位去極化，從而誘發(fā)一瞬間ROS的大量生成[11]。

2.2 ROS引起的mtDNA損傷MT是產(chǎn)生ROS的主要場所，也是氧化損傷的主要靶點。有害刺激可使MT產(chǎn)生過量的ROS，進而氧化mtDNA、MT內(nèi)膜上的心磷脂及MT順烏頭酸和鐵調(diào)節(jié)蛋白1等重要蛋白，加劇MT損傷，導(dǎo)致MT呼吸鏈活力降低、三羧酸循環(huán)障礙、ATP生成減少、MT膜電位下降、鈣離子超載、細胞內(nèi)抗氧化物酶水平降低，更嚴(yán)重的有害刺激可激活caspases級聯(lián)途徑而誘導(dǎo)細胞凋亡；受損的MT又可進一步激發(fā)ROS的產(chǎn)生，二者互為因果，形成惡性循環(huán)[10]。更值得關(guān)注的是，由于mtDNA無組蛋白保護，DNA校讀和修復(fù)系統(tǒng)不完善，且靠近MT內(nèi)膜的氧自由基來源，因此易受ROS攻擊[12]。mtDNA遭受各種類型損害，包括mtDNA點突變、缺失、插入和mtDNA復(fù)制等，引起不同類型的氧化損傷，包括單鏈斷裂、雙鏈斷裂和氧化性堿基修飾等[13]；其中8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷(8-oxo-deoxyguanosine，8-OHdG)是ROS攻擊DNA堿基產(chǎn)生的最主要的DNA加合物，性質(zhì)穩(wěn)定，易于檢測，可靈敏反映DNA堿基序列氧化受損的程度，其可作為ROS誘導(dǎo)DNA損傷的細胞標(biāo)記[14]。

2.3 ROS引起mtDNA損傷的可能機制研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的·OH可直接攻擊mtDNA分子中核糖的C3和C4位點造成其斷裂,且·OH可以每秒約9×109mol的擴散速率攻擊堿基雙鍵，主要導(dǎo)致嘧啶的C5和C6及嘌呤的C4、C5和C8羥基化[15]。經(jīng)修復(fù)酶切除也可引起單鏈斷裂，其中8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(8-oxyguanine DNA glycosylase，OGG1)是病變堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)的主要酶，其通過催化受損的8-OHdG堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵分裂而有效切除與腺嘌呤錯配的8-OHdG，引起單鏈斷裂[12]。

ROS通過降低mtDNA聚合酶γ的校對能力而導(dǎo)致mtDNA復(fù)制錯誤[16]；ROS也可以誘發(fā)mtDNA的一系列氧化修飾，引起解偶聯(lián)蛋白2基因、電位依賴性陰離子通道1、過氧化還原酶3基因受損，導(dǎo)致mtDNA交聯(lián)和突變等，干擾mtDNA的復(fù)制[17]。ROS可引起mtDNA復(fù)制過程中重復(fù)序列的滑動錯配，導(dǎo)致mtDNA片段缺失，繼而形成電子漏，增加ROS的產(chǎn)生；細胞內(nèi)ROS增多促使p53基因高表達，繼而p53與特異性干擾蛋白1結(jié)合，抑制脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic apyrimidinic endonuclease1，APE1)基因的轉(zhuǎn)錄[18]；APE1是一個重要的修復(fù)核苷酸損傷的堿基切除中間酶，其低表達可引起B(yǎng)ER障礙，使形成的DNA氧化損傷不易修復(fù)，受損的DNA片段積累，進一步加劇ROS的釋放[19]。

氧化應(yīng)激可影響mtDNA拷貝數(shù)(mtDNA copy number，mtDNA-CN)，具有雙重調(diào)節(jié)的特點。mtDNA-CN是MT功能的間接生物標(biāo)記。氧化應(yīng)激不僅對mtDNA復(fù)制酶直接造成損害,而且mtDNA的D-環(huán)區(qū)對ROS較敏感，易引起基因突變，影響mtDNA的拷貝[20]。輕度應(yīng)激時，損傷MT呼吸鏈，刺激mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄，引起mtDNA-CN增加，以代償MT呼吸功能的降低；重度應(yīng)激時，損傷加劇，超出MT的自我調(diào)控能力，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄速率均下降，引起mtDNA-CN下降[21]。

總之，MT既是ROS的主要靶標(biāo)，又是其主要來源。mtDNA損傷影響呼吸鏈的功能，導(dǎo)致ROS水平增高及ATP合成減少，由于氧化產(chǎn)物不斷堆積，進一步使mtDNA缺失、突變甚至大片段丟失，形成ROS-mtDNA損傷的“惡性循環(huán)”[22]。

3 mtDNA氧化損傷與AS

AS是心血管疾病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，其特點是大、中動脈內(nèi)膜局限性增厚，伴大量脂質(zhì)沉積、單核細胞和淋巴細胞浸潤、血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell,VEC)異常凋亡，中膜平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)遷移至內(nèi)膜并大量增生，形成突出于腔面的VSMC纖維帽及深部富含壞死成分的脂核。隨著病程發(fā)展，斑塊破裂形成血栓，伴有潰瘍、鈣化等繼發(fā)改變[23]。AS發(fā)病機制復(fù)雜，有脂質(zhì)代謝異常、炎癥、內(nèi)皮損傷和氧化應(yīng)激等學(xué)說。近年來有研究表明，mtDNA損傷和功能障礙介導(dǎo)了AS的發(fā)生、發(fā)展[1]。

3.1 AS病理過程中的mtDNA 損傷mtDNA是氧化應(yīng)激損傷的重要靶分子，在AS病理過程中客觀存在mtDNA的損傷。內(nèi)皮功能障礙是AS的最初征兆之一，AS發(fā)病早期，即可在血管壁VEC中觀察到受損的mtDNA[24]。DOCHERTY等[25]研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊中VSMC的 mtDNA完整性被破壞、拷貝數(shù)減少及修復(fù)能力減弱，且在AS斑塊中VSMC存在的mtDNA 損傷及不穩(wěn)定性與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[26]。WANG等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食的Ldlr-/-小鼠AS病變中，存在巨噬細胞(macrophages，M?)MT氧化應(yīng)激及mtDNA損傷，并證實存在mtDNA功能缺陷。MARTINE等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在患者及兔AS斑塊VEC、VSMC和M?中均有氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG增多且長期存在，說明mtDNA受損并伴隨AS的發(fā)展。MAHMOUDI等[29]研究發(fā)現(xiàn)，患者AS斑塊中VSMC和M?內(nèi)磷酸化-共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因(p-ataxia telangiectasia mutated，p-ATM)和磷酸化的組蛋白H2AX(Histone H2AX phosphorylation，YH2AX)呈高表達；離體培養(yǎng)AS斑塊中VSMC內(nèi)同樣發(fā)現(xiàn)p-ATM和YH2AX 增加，表明AS同時存在DNA損傷修復(fù)酶的活化及DNA鏈斷裂。以上研究說明，AS病理過程中客觀存在mtDNA損傷。

3.2 ROS、mtDNA損傷在AS發(fā)生、發(fā)展中的作用機制ROS、mtDNA損傷與AS的關(guān)系見圖1。導(dǎo)致AS的外源性刺激因素如年齡、高脂蛋白血癥、吸煙、肥胖、胰島素抵抗等均可使細胞產(chǎn)生過多ROS[4]。在AS形成階段，血管壁內(nèi)ROS增加[23]。mtDNA對氧化應(yīng)激較敏感，ROS是導(dǎo)致mtDNA損傷的主要因素之一[1]。mtDNA功能缺陷已被證明在AS發(fā)展的所有階段中都起著至關(guān)重要的作用，并被認(rèn)為是AS的臨床前標(biāo)志[30]。

圖1 ROS、mtDNA損傷與AS關(guān)系示意圖

3.2.1 受損的mtDNA通過誘導(dǎo)血管壁細胞功能障礙及凋亡引發(fā)并促進ASBALLINGER等[31]在研究ApoE-/-小鼠AS斑塊進展中發(fā)現(xiàn)，mtDNA損傷導(dǎo)致VEC和VSMC代謝過程受損(尤其是氧化磷酸化)及VSMC去分化、表型改變，這些均是AS的重要早期事件，也可能是AS的重要起因；mtDNA的完整性被破壞及MT呼吸功能障礙引起了ROS的進一步升高，推動了AS的進展。YU等[32]研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的VSMC mtDNA嚴(yán)重損傷，伴隨mtDNA編碼的細胞色素C氧化酶的3個亞基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ減少，繼而發(fā)生VSMC異常增殖，過量的細胞凋亡和炎癥因子釋放；且VSMC mtDNA損傷導(dǎo)致MT膜電位的喪失，并通過上調(diào)Pink1激酶降低ATP的產(chǎn)生，這些現(xiàn)象均促進了AS斑塊的易損性。高脂喂養(yǎng)的Ldlr-/-小鼠的M?中mtDNA損傷增加，誘導(dǎo)其極化為M1型，通過進一步增強氧化應(yīng)激反應(yīng)加重了AS[33]。mtDNA缺陷會削弱血管壁細胞、單核細胞和M?中呼吸亞單位的形成，降低MT呼吸功能，減少ATP生成，導(dǎo)致細胞增殖能力受抑制和細胞凋亡、死亡[34]；VEC的凋亡導(dǎo)致血管壁完整性被破壞，容易引發(fā)脂質(zhì)沉積，VSMC過度死亡可使斑塊的纖維帽變得脆弱，M?過度死亡將促進壞死核心的形成和AS斑塊的不穩(wěn)定[22]。

3.2.2 mtDNA通過影響細胞代謝引起AS有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠mtDNA變異導(dǎo)致骨骼肌成肌細胞釋放成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)[35]，F(xiàn)GF21是一種多肽激素，被認(rèn)為是預(yù)測AS的生物標(biāo)志物，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖的動態(tài)平衡以及能量代謝，引發(fā)和促進AS[36]。此外，當(dāng)mtDNA損傷時，ATP水平降低，AMP/ATP比值升高，繼而引起5′-腺嘌呤核苷酸和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的γ亞基結(jié)合，使AMPK構(gòu)象發(fā)生改變而被激活。AMPK能夠抑制膽固醇和脂肪酸的合成，抑制糖元異生，使循環(huán)血中的游離脂肪酸增多，從而增加AS發(fā)生的風(fēng)險[25,31]。

3.2.3 mtDNA功能障礙通過促炎反應(yīng)參與AS進展mtDNA損傷或缺乏引起VEC表型改變，激活NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體[37]，進一步剪切白細胞介素(interleukin，IL)-1β前體為成熟形式，IL-1β激活釋放后促進血管內(nèi)皮損傷，放大AS的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AS斑塊向易損型斑塊發(fā)展[38]；mtDNA 缺失引起的紊亂的鈣離子流、累積的ROS及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等作為有害介質(zhì)活化NLRP3炎癥小體[39]，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進AS進展[40]。此外，M?受損的mtDNA可與NLRP3結(jié)合形成復(fù)合物，再結(jié)合凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；繼而mtDNA與caspase-1前體結(jié)合，形成炎癥小體，同時促進M?凋亡及MT中ROS產(chǎn)生[41]，加劇AS的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，AS小鼠的單核細胞mtDNA損傷也可直接促進腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和IL-1、IL-6、IL-12等釋放[31]。此外，mtDNA參與Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)相關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)而加劇AS。受損mtDNA中存在的非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤核苷酸DNA可強烈誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，直接激活TLR9，活化的TLR9通過傳導(dǎo)蛋白MYD88介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB信號通路的激活，刺激M?釋放大量炎癥因子[42-43]；同時TLR9還能刺激TNF-α分泌，增加CD4+T細胞對冠狀動脈VSMC的殺傷力，促進AS的發(fā)生、發(fā)展[44]。

3.2.4 mtDNA通過逃脫MT自噬促進AS研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA損傷可選擇性誘發(fā)VEC凋亡而促進易損型AS斑塊的形成，而MT自噬能夠通過清除受損的mtDNA抑制內(nèi)源性凋亡來抵抗AS斑塊進展[45]。ZHANG等[46]研究發(fā)現(xiàn)，AS患者血漿和斑塊中LL37-mtDNA復(fù)合物(mtDNA和人類抗菌肽LL-37結(jié)合形成)水平明顯升高，該復(fù)合物可抵抗DNase Ⅱ 的降解，并逃脫自噬的識別，繼而激活TLR9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可作為AS形成的關(guān)鍵介質(zhì)。DING等[45]認(rèn)為，氧化型低密度脂蛋白與凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體結(jié)合誘導(dǎo)了內(nèi)皮細胞ROS的生成，并形成正反饋回路；ROS的過量產(chǎn)生破壞了mtDNA并激活MT自噬，但部分受損的mtDNA泄漏到細胞質(zhì)中，這些逃脫自噬的mtDNA可觸發(fā)強效的、TLR9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進AS的發(fā)展。2020年，F(xiàn)INSTERER[47]對29篇描述MT突變文章分析發(fā)現(xiàn)，mtDNA突變與AS的發(fā)展及頸動脈狹窄、局部缺血、冠狀動脈硬化和腦后動脈狹窄等各種AS表現(xiàn)有關(guān)；而且mtDNA-CN改變、mtDNA甲基化、mtDNA單倍型和表觀遺傳變化均可能導(dǎo)致AS[48-49]。

4 結(jié)語與展望

ROS是破壞mtDNA的主要因素之一，ROS和mtDNA損傷在AS的發(fā)病中起著重要作用，它們之間互為因果。mtDNA通過影響血管炎癥、細胞凋亡、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和自噬等參與AS的啟動和進展[34]，修復(fù)或阻止mtDNA 的氧化損傷以降低AS斑塊的負荷和易損性已成為防治心血管疾病的有效靶標(biāo)。

目前，MT靶向抗氧化劑治療已有了新突破，研究發(fā)現(xiàn)，MT靶向抗氧化劑線粒體醌(mitoquinone，MitoQ)可減少老年小鼠的血管內(nèi)皮功能障礙[50]，MitoQ的全身給藥減少了ApoE-/-小鼠AS病變區(qū)M?的積累和平滑肌細胞的增殖[51]；并且MitoQ已在口服劑量為1 mg·kg-1的臨床試驗的第1階段和第2階段顯示出其有效性[52]。其他靶向MT的抗氧化劑如白藜蘆醇、槲皮素、褪黑素和姜黃素等[53-54]的臨床研究也仍在持續(xù)進行。值得關(guān)注的是，第4代抗氧化劑蝦青素是迄今為止自然界發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化分子,可有效清除細胞內(nèi)ROS，修復(fù)DNA損傷，抑制炎癥與AS[55]。由于基礎(chǔ)研究與臨床治療之間的差異，包括藥物的生物利用度、劑量的微調(diào)和遞送方法等問題，至今仍僅有一個天然抗氧化劑維生素E被批準(zhǔn)為臨床用藥[56]。相比之下，合成抗氧化劑普羅布考經(jīng)人為優(yōu)化設(shè)計，具有抗氧化、調(diào)血脂、促進mtDNA損傷后修復(fù)、減緩AS病變等作用，多項臨床研究證實，其能夠顯著降低心腦血管急性事件發(fā)生率[57]。在最新的《藥理學(xué)》中，普羅布考已被列為抗氧化劑的代表性藥物[56]。

ROS也可不通過介導(dǎo)的mtDNA損傷而通過其他途徑促進AS；mtDNA損傷也不一定導(dǎo)致ROS增加，但仍可促進AS[33]。因此，需要考慮MT功能障礙的其他方面，選擇抗氧化劑治療的適當(dāng)時機和精準(zhǔn)靶點。