張 媛，王莉華，郭 燕，劉憲凱，呂國慶，黃 琰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液一科，河南 衛(wèi)輝 453100)

白血病是嚴重危害人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和病死率在兒童及青少年癌癥中居首位[1-2]。近年來，雖然免疫治療在白血病的治療中取得了較大進展，但化學治療在白血病的治療中仍占至關(guān)重要地位[3]。因此，尋找有效的化學治療藥物并研究其作用機制對白血病的治療意義重大[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，青光眼、糖尿病、冠狀動脈硬化性心臟病、癌癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳有著密切關(guān)系[7]。甲基化修飾是哺乳動物中最常見的RNA修飾，該修飾過程可逆，由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase like 14，METTL14)、腎母細胞瘤1-結(jié)合蛋白(Wilms tumor1-associating protein，WTAP)所組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體及去甲基化酶脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)、α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶AlkB同源蛋白5(AlkB homolog 5，ALKBH5)以及閱讀器YTH結(jié)構(gòu)域家庭蛋白(YTH domain-containing family protein，YTHDF)家族等共同調(diào)控[8-9]。研究表明，腫瘤細胞的甲基化水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥等密切相關(guān)[10-13]。FTO是第1個被發(fā)現(xiàn)具有N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)去甲基化酶活性的蛋白質(zhì)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的發(fā)生過程中發(fā)揮著癌基因的作用，在混合譜系白血病(mixed-lineage leukemia，MLL)中呈高表達，右旋二羥基戊二酸[(2R)-2-hydroxyglutarate，R-2-HG]可通過FTO/m6A/MYC/CEBPA途徑發(fā)揮抑制腫瘤細胞活性的作用[15-17]。大黃酸是一種天然的蒽醌衍生物，可增加全反式維甲酸誘導(dǎo)的NB4細胞分化[18]。同時，大黃酸也是RNA去甲基化酶FTO的抑制劑，可以降低細胞中FTO表達水平[19]。本研究擬通過研究不同濃度大黃酸對不同白血病細胞FTO表達及細胞增殖和凋亡的影響，探討大黃酸治療白血病的機制，以期為指導(dǎo)白血病臨床用藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器白血病細胞株HL60、NB4、Naml6、THP1購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Corning公司，大黃酸購自美國Selleck公司，細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量/濃度測定試劑盒、含體積分數(shù)0.05%Tween 20的Tris緩沖液溶液(Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20，TBST)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白Ⅴ-別藻藍蛋白(annexinⅤ-allophycocyanin，Annexin-Ⅴ-APC)/碘化丙啶(propidine iodide，PI)、Binding buffer 購自美國BD公司，二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司，兔抗人FTO、兔抗人caspase-3、鼠抗人β-actin一抗及羊抗鼠和羊抗兔二抗購自美國Abcam公司，增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司；生物化學培養(yǎng)箱購自上海博訊實業(yè)有限公司，超凈工作臺、低溫高速離心機購自美國Thermo scientific 公司，CytoFLEX LX流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司,蛋白垂直電泳儀、蛋白垂直轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 公司，ChemiScope 3300 Mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組將HL60、NB4、Naml6、THP1細胞接種于含體積分數(shù)10%FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代。收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HL60、NB4、Naml6、THP1細胞，以每孔 5×103個細胞均勻接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機分為對照組和10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組分別加入10 μL 終濃度為10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸，對照組細胞加入等量的DMSO，并設(shè)空白對照組(只加100 μL培養(yǎng)基，不加細胞)用于增殖抑制率檢測，每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。各組細胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8實驗檢測各組細胞增殖能力取各組HL60、NB4、Naml6、THP1細胞，于培養(yǎng)24、48、72 h 時，每孔分別加入10 μL CCK-8試劑，然后置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4 h，使用酶標儀測定450 nm波長下的吸光度值，并計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]×100%。實驗重復(fù)3次，取均值。增殖抑制率越高代表增殖能力越低。

1.2.3 Annexin-Ⅴ-APC/PI雙染法檢測各組細胞凋亡情況取各組培養(yǎng)72 h細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細胞，加入100 μL Binding buffer重懸細胞，再分別加入5 μL的Annexin-Ⅴ-APC和PI，輕輕混勻，冰上避光染色30 min，每管再加入400 μL Binding buffer，使用CytoFLEX LX 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 Western blot法檢測各組細胞中FTO和caspase-3蛋白相對表達量取各組培養(yǎng)72 h細胞，用PBS洗滌2遍，300×g離心5 min后，取細胞沉淀加入蛋白裂解液，使用BCA定量試劑盒進行蛋白定量，1 200×g離心10 min后，取上清液加入5×Loading buffer，100 ℃變性10 min。每孔取100 μg蛋白樣品上樣，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺鈉凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，用質(zhì)量分數(shù)5%的脫脂牛奶室溫封閉 1 h，TBST清洗3次，分別加入稀釋后的兔抗人FTO一抗(1:1 000)、兔抗人caspase-3一抗(1:1 000)4 ℃封閉過夜，TBST清洗3次，然后加入稀釋后二抗(1:5 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗3次，加入ECL發(fā)光液，在暗室中曝光、顯影，使用ChemiScope 3300 Mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)掃描、分析灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達量，實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 5組白血病細胞增殖抑制率比較結(jié)果見表1。24、48、72 h時，10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞增殖抑制率高于對照組，20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞增殖抑制率高于10 μmol·L-1大黃酸組，40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞增殖抑制率高于20 μmol·L-1大黃酸組，80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞增殖抑制率高于40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。24、48、72 h時，10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細胞增殖抑制率高于對照組，48、72 h時，80 μmol·L-1大黃酸組THP1細胞增殖抑制率高于10、20、40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);24 h時,10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細胞增殖抑制率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 5組HL60、NB4、Nalm6、THP1細胞增殖抑制率比較

2.2 5組白血病細胞凋亡率比較結(jié)果見表2。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4細胞凋亡率顯著高于對照組，20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60和NB4細胞凋亡率高于 10 μmol·L-1大黃酸組，40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60和NB4細胞凋亡率高于20 μmol·L-1大黃酸組，80 μmol·L-1大黃酸組HL60和NB4細胞凋亡率高于40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。40、80 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細胞凋亡率顯著高于對照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；40 μmol·L-1大黃酸組與80 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。5組間THP1細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 5組HL60、NB4、Nalm6、THP1細胞凋亡率比較

2.3 5組白血病細胞中FTO和caspase-3蛋白相對表達量比較結(jié)果見表3和圖1、圖2、圖3、圖4。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞中FTO蛋白表達水平顯著低于對照組，caspase-3蛋白相對表達量顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞中FTO蛋白相對表達量顯著低于10 μmol·L-1大黃酸組，caspase-3蛋白表達水平顯著高于10 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞中FTO蛋白相對表達量顯著低于20 μmol·L-1大黃酸組，caspase-3蛋白相對表達量顯著高于20 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞中FTO蛋白相對表達量顯著低于40 μmol·L-1大黃酸組，caspase-3蛋白相對表達量顯著高于40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。5組THP1細胞中FTO和caspase-3蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 5組HL60、NB4、Nalm6、THP1細胞中FTO和caspase-3蛋白相對表達量比較

1：對照組；2：10 μmol·L-1大黃酸組；3：20 μmol·L-1大黃酸組；4：40 μmol·L-1大黃酸組；5：80 μmol·L-1大黃酸組。

1：對照組；2：10 μmol·L-1大黃酸組；3：20 μmol·L-1大黃酸組；4：40 μmol·L-1大黃酸組；5：80 μmol·L-1大黃酸組。

1：對照組；2：10 μmol·L-1大黃酸組；3：20 μmol·L-1大黃酸組；4：40 μmol·L-1大黃酸組；5：80 μmol·L-1大黃酸組。

3 討論

近年來，白血病的發(fā)病率仍在逐年增高，雖然嵌合抗原受體T細胞的問世為很多急性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤等血液腫瘤患者的治療帶來了希望，但關(guān)于急性髓系白血病相關(guān)靶點的設(shè)計仍未取得很好的進展，因此，化學治療和靶向治療仍占據(jù)著至關(guān)重要的地位[6，20-24]。m6A甲基化修飾于20世紀70年代被發(fā)現(xiàn)，是最常見、最豐富的真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾形式之一[25]，在白血病的發(fā)展過程中其通過影響白血病干細胞目標基因的轉(zhuǎn)錄分化功能，從而促使白血病的發(fā)生[26]。FTO是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶活性能力的蛋白質(zhì)[14]。WIENER等[12]研究認為，F(xiàn)TO作為一種m6A的去甲基化酶，在白血病的發(fā)生以及全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)介導(dǎo)的白血病細胞分化中起著關(guān)鍵的致癌作用，F(xiàn)TO可通過降低其關(guān)鍵靶基因如ASB2和RARA基因的m6A水平，從而調(diào)節(jié)白血病細胞內(nèi)部的相關(guān)信號通路，改變其生物學特性。CHEN等[19]報道，大黃酸是RNA去甲基化酶FTO的抑制劑，可降低細胞中FTO水平。雖然大黃酸作為一種瀉藥和胃藥已經(jīng)使用了很長時間，而且其具有多種藥理活性，如抗癌、抗菌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗血管生成、抗纖維化等[27]，但關(guān)于其在白血病中抗腫瘤作用研究較少。有學者研究表明，大黃酸能夠通過活性氧介導(dǎo)的線粒體死亡途徑誘導(dǎo)HL60細胞凋亡，但其使用的細胞類型單一，而且大黃酸作為一種FTO的抑制劑在白血病細胞中的作用未見報道[28]。

本研究使用10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸處理白血病細胞HL60、NB4、Nalm6和THP1，并設(shè)置加入等量的DMSO作為對照組，CCK-8檢測結(jié)果顯示，各濃度大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細胞增殖抑制率高于對照組，隨大黃酸濃度增加，HL60、NB4、Nalm6細胞增殖抑制率顯著增高，且呈濃度依賴性。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細胞增殖抑制率高于對照組;10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細胞增殖抑制率比較差異均無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果說明大黃酸可以抑制M3型急性髓系白血病細胞HL60和NB4及急性淋巴細胞白血病細胞Nalm6的增殖，對THP1細胞的增殖則幾乎無作用。Annexin-Ⅴ-APC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，各濃度大黃酸組HL60、NB4細胞凋亡率高于對照組，且隨大黃酸濃度增加，HL60、NB4細胞凋亡率顯著增加，呈濃度依賴性；40、80 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細胞凋亡率顯著高于對照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組；對照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果說明大黃酸可以呈濃度依賴性顯著誘導(dǎo)M3型急性髓系白血病細胞HL60和NB4的凋亡，且對急性淋巴細胞白血病細胞Nalm6的凋亡有一定作用，而對THP1的凋亡沒有明顯作用。由此體外實驗可以證實，大黃酸對M3型急性髓系白血病具有顯著抗腫瘤的作用，對急性淋巴細胞白血病有一定的抗腫瘤作用。為進一步探討其促進腫瘤細胞凋亡的可能機制，本研究通過Western blot法檢測分析各組細胞中FTO蛋白和caspase-3蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，隨著大黃酸濃度的增高，白血病細胞HL60、NB4、Nalm6中FTO蛋白相對表達量顯著降低，caspase-3蛋白表達水平顯著增高；而不同濃度大黃酸組THP1細胞中FTO和caspase-3蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義；這些結(jié)果提示大黃酸可以通過抑制FTO的表達來誘導(dǎo)M3型急性髓系白血病細胞HL60和NB4及急性淋巴細胞Nalm6的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸可能通過抑制FTO蛋白表達誘導(dǎo)M3型AML細胞HL60和NB4凋亡并抑制其增殖，而且對急性淋巴白血病細胞Nalm6也有一定的作用，對THP1無明顯作用，這將為大黃酸在白血病的臨床治療中提供依據(jù)。但大黃酸抑制FTO的表達與PML-RARα融合基因的相關(guān)性以及其下游通路還有待更深入的研究。