孟凡萍，郝 坡（.重慶三峽中心醫(yī)院,重慶404000；.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校,重慶40000）

新型冠狀病毒（novel coronavirus pneumonia，NCP）即“2019-nCOV”，因2019年武漢病毒性肺炎病例而被發(fā)現，于2020年1月12日被世界衛(wèi)生組織命名。人群普遍易感，主要的傳播途徑是呼吸道飛沫傳播和近距離接觸傳播。最新研究提示，有人從大便中分離出冠狀病毒，因而可能還存在消化道等傳播途徑，糞便標本存在潛在的傳染性,可能成為新的傳播途徑[1]。新型冠狀病毒引起的肺炎叫新型冠狀病毒肺炎，潛伏期3～7天，多低于14天，也有34天的個例。以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現，少數患者伴有流涕、腹瀉等癥狀，重癥患者多在一周出現呼吸困難，胸片呈雙肺浸潤性病灶，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合癥。

因本課題組目前的工作主要負責萬州片區(qū)新冠病毒的篩查，在日常檢測中發(fā)現新冠病毒感染者可見淋巴細胞降低的現象。為進一步探討淋巴細胞降低與新冠病毒感染的內在聯系，課題組決定開展本研究。本研究對輕型和重型病患的淋巴細胞亞群進行分析研究，旨在為新型冠狀病毒肺炎患者與其免疫系統之間的相互聯系提供一些理論依據，并為其治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2020年2月于本院就診的輕型冠狀病毒肺炎患者（輕型組）35例、重型冠狀病毒肺炎患者（重型組）11例，以健康體檢者（NC組）20例為對照，年齡8個月～71歲，平均年齡52.3歲。所有病例均經過流行病學、臨床表現及核酸檢測確診，排除其他呼吸道疾病及免疫性疾病，以及對本研究所涉及疾病有影響的其他疾病，患者亦未接受過免疫治療。

1.2 儀器與試劑 Cobas Z480 熒光定量PCR 儀購自德國Cobas 公司，淋巴細胞亞群分析試劑盒、BD FAS CALIBUR 流式細胞分析儀以及FCAP CELLQUEST 分析軟件為美國BD 公司產品，病毒核酸提取試劑盒（磁珠法）及GeneRotex96 核酸提取儀為西安天隆科技有限公司產品，新型冠狀病毒2019-nCOV 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）為湖南圣湘生物科技有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 2019-nCOV 核酸的提?。簩⒉∪藰颖荆ㄑ适米?、鼻拭子、肛拭子等）置于56℃孵箱中30min 滅活后，取200μl 拭子洗液加入到試劑板中，放入核酸提取儀中，經裂解、洗滌、洗脫，進行自動化提取2019-nCOV RNA。

1.3.2 熒光定量PCR：將提取的病毒RNA 加入到PCR 反應液中，在熒光定量PCR 儀上檢測。選擇FAM 通道檢測2019-nCOV ORF-lab 區(qū)域，ROX 通道檢測2019-nCOV N 基因，HEX 通道檢測內標。PCR反應程序：50℃ 30min；95℃ 1min；95℃15s，60℃ 30s，45 cycles；25℃ 10s。Ct≤40 判斷為陽性。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）測定：PCR 操作、反應過程及結果判定按照標準操作程序進行，并設立陽性質控品和陰性對照，共同進行檢測和分析。

1.3.3 流式細胞檢測淋巴細胞亞群變化：用CD3+（PE 標記）和CD4+（PerCP 標記）、CD8+（FITC標記）分別設門，分別圈出輔助性T細胞和細胞毒性T細胞，用CD22+（FITC 標記）和CD3+（PE 標記）設門，圈出B細胞，用CD3+（PE 標記）和CD56+（PerCP 標記）設門，圈出NK細胞，用CD3+（PE標記）設門，圈出淋巴細胞。通過對數據進行采集和分析，計算淋巴細胞總數、T淋巴細胞數及比例、B淋巴細胞數及比例、NK細胞數及比例、CD4+T細胞數及比例、CD8+T細胞數及比例，以及CD4+/CD8+比值。

1.4 統計學分析 采用SPSS19.0 統計軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，三組間的均數比較采用單因素方差分析，兩組間的均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 核酸檢測 35例輕癥患者和11例重癥患者和20例健康體檢者的核酸分別進行ORF-lab 基因和N基因的陽性檢測。經檢測，35例輕癥患者和11例重癥患者的兩個基因均為陽性，而20例健康體檢者兩個基因均為陰性。

2.2 淋巴細胞亞群分析 見表1。兩組患者的淋巴細胞總數、T淋巴細胞數（比例）、CD4+T細胞數（比例）、CD8+T細胞數（比例）、B淋巴細胞數（比例）、NK細胞數（比例）的差異均有統計學意義（均P<0.05），且重癥組比輕癥組降低的更為顯著，差異具有統計學意義（P<0.05）；兩組患者的CD8+T細胞數和CD4+/CD8+較對照組升高，差異有統計學意義（P<0.05），但輕癥組與重癥組差異不明顯，無統計學意義（P>0.05）；兩組患者B淋巴細胞比例較對照組顯著升高（P<0.05），且重癥組明顯高于輕癥組（P<0.05），差異均有統計學意義；NK細胞比例在重癥組可見明顯升高（P<0.05），而在輕癥組和對照組則差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 三組淋巴細胞亞群檢測結果分析（±s）

表1 三組淋巴細胞亞群檢測結果分析（±s）

項 目 輕癥組 重癥組 對照組 輕癥組 vs 對照組 重癥組 vs 輕癥組t P t P總淋巴細胞數（cell/L） 1 049±493 609±279 2 115±311 0.121 0.010-0.307 0.031 T淋巴細胞數（cell/L） 739±388 399.45±236.06 1 447±209 0.511 0.012 0.536 0.041 T淋巴細胞比例（%） 68.97±12.68 59.62±16.9 79.4±17.4 0.029 0.009 1.208 0.021 CD4+T（cell/L） 388.75±208.16 208.82±111.37 782±249-1.201 0.020 1.036 0.020 CD4+T/總淋巴細胞（%） 37.77±9.52 32.73±9.33 40.0±12.44-0.774 0.006-0.852 0.030 CD8+T（cell/L） 263.75±131.66 194.19±154.26 631±41 0.045 0.001-0.043 0.062 CD8+T/總淋巴細胞（%） 27.98±8.94 27.12±13.12 24.2±12.49 0.632 0.005 0.129 0.070 CD4+/CD8+ 1.47±0.6 1.5±0.84 1.24±0.19-0.142 0.005 0.256 0.112 B淋巴細胞數（cell/L） 172±106 110.36±51.75 322±65 0.065 0.020-0.744 0.011 B淋巴細胞比例（%） 18.98±8.23 21.82±11.6 12.9±5.3-0.352 0.013-0.114 0.016 NK細胞數（cell/L） 135.75±92.1 89.72±79.68 315±41 0.201 0.021 0.059 0.098 NK細胞比例（%） 12.19±10.0 16.68±10.58 12.7±14.9 0.105 0.151 0.066 0.011

3 討論

2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）是2019 新型冠狀病毒性肺炎的病原體，感染病毒的人會出現程度不同的癥狀，輕癥有發(fā)燒或咳嗽癥狀，重度會發(fā)展為肺炎，更嚴重可導致死亡[2-3]。2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織發(fā)布新型冠狀病毒感染肺炎疫情為國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，3月11日，世界衛(wèi)生組織總干事譚德賽宣布，新型冠狀病毒已構成全球大流行。新型冠狀病毒主要的傳播途徑是呼吸道飛沫傳播和接觸傳播。各個年齡段的人都可能被感染，其中老年人和體弱多病的人更容易被感染。

2020年1月24日，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所成功分離了我國第一株病毒，同時發(fā)布了毒種信息、病毒在電鏡下的形態(tài)、核酸檢測引物和探針序列重要權威信息[4-7］，對病毒有了一定的認識。研究發(fā)現，新冠病毒的刺突蛋白結構與中東呼吸綜合征（MERS 病毒）和“非典”（SARS病毒）的刺突蛋白結構非常相近，并已確認SARS病毒的中和抗體可與新冠病毒蛋白相結合[8]。

華中科技大學團隊率先完成了9例新冠肺炎死者遺體的病理解剖工作。他們發(fā)現，新冠病毒不僅損害感染者的肺臟，而且還損害感染者的免疫系統及其他組織器官。有學者對新冠病毒患者不同病情狀態(tài)下淋巴細胞、白細胞介素-6 及炎癥指標的變化及淋巴細胞亞群與CT 肺炎影像指數的相關性進行研究，發(fā)現不同程度的重癥患者的IL-6 與CRP水平均顯著高于輕癥患者(P<0.01)，呼吸困難越嚴重的患者，其淋巴細胞計數、T淋巴細胞數、B淋巴細胞數、CD4+T 和CD8+T水平越低，且不同程度重癥患者與輕癥患者均有顯著差異（P<0.05）；癥狀越嚴重的患者其淋巴細胞比率越低，故IL-6，淋巴細胞亞群、CRP 等指標能預測新型冠狀病毒肺炎患者的病情變化，新冠肺炎患者T淋巴細胞數值越低，CT 顯示肺部炎癥越嚴重，病情越嚴重[9-11]。有研究在對重型和危重型新型冠狀病毒肺炎患者外周血淋巴細胞計數和淋巴細胞亞群進行分析，發(fā)現重型組、危重組的淋巴細胞計數、T淋巴細胞計數、CD4+T淋巴細胞計數、CD8+T淋巴細胞計數和B淋巴細胞計數均低于普通組，差異具有統計學意義（P<0.05），而危重組的淋巴細胞計數、T淋巴細胞計數、CD4+T淋巴細胞計數和NK細胞計數低于重型組，差異具有統計學意義（P<0.05），反映了COVID-19患者機體免疫系統受損及其嚴重程度[12-13]。許嬌等[14]在對不同臨床分型的COVID-19患者的外周血淋巴細胞分析發(fā)現，COVID-19患者外周血淋巴細胞數量降低,且重癥患者的淋巴細胞水平顯著低于輕癥患者。王琳琳等[15]發(fā)現新冠組患者外周血中WBC 計數，Neu 計數及NLR值均低于甲流組，差異具有統計學意義。淋巴細胞計數低于健康組，差異具有統計學意義。外周血細胞檢測中WBC 計數、Neu 計數、Lym 計數及NLR值指標可用于輔助鑒別COVID-19患者、甲流患者、健康人群，對COVID-19 診斷有一定臨床意義。

本課題的主要研究目的就是了解新型冠狀病毒對患者外周血淋巴細胞亞群的影響。研究發(fā)現，輕癥和重癥患者的淋巴細胞總數、T淋巴細胞數（比例）、CD4+T細胞數（比例）、CD8+T細胞數（比例）、B淋巴細胞數（比例）、NK細胞數（比例）的差異均有統計學意義（P<0.05），且重癥組比輕癥組降低的更為顯著，差異具有統計學意義（P<0.05）。兩組患者的CD8+T細胞數和CD4+/CD8+較對照組有所升高（P<0.05），但輕癥組與重癥組組間差異不明顯，無統計學意義（P>0.05）。兩組患者B淋巴細胞比例較對照組顯著升高（P<0.05），且重癥組明顯高于輕癥組（P<0.05），差異均有統計學意義。NK細胞比例在重癥組可見明顯升高（P<0.05），而在輕癥組和對照組則差異無統計學意義（P>0.05）。

綜合近期發(fā)表的新冠病毒對感染者淋巴細胞和免疫功能相關文獻及本課題的研究結果，充分說明新型冠狀病毒對患者的免疫系統影響比較復雜，不僅存在免疫功能紊亂，還存在一定的免疫缺陷，甚至是免疫監(jiān)視水平的變化，尤其是對機體細胞免疫水平影響較大，主要表現為淋巴細胞總數、淋巴細胞亞群數量和比例下降，導致機體免疫功能降低，尤其是細胞免疫功能降低，可以肯定新型冠狀病毒肺炎改變了患者的免疫功能和免疫狀態(tài)，研究其免疫功能的變化對于新冠肺炎的治療具有重要價值。