趙智凝，武 易，劉 芳，何 瑩，楊 榮，景 濤(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)病理科，西安 710054)

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)以腎臟結(jié)構(gòu)、功能改變?yōu)橹饕卣?，?dǎo)致腎功能損害，全球發(fā)病率為8%～16%[1-2]。目前常采用腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate，GFR)、尿清蛋白、肌酐作為評(píng)估腎功能的指標(biāo)或者腎損傷標(biāo)志物，但一些干擾因素會(huì)影響結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性[1-3]，如MISCHAK 等[4]研究發(fā)現(xiàn)采用血清肌酐水平評(píng)估患者腎功能狀態(tài)，超過(guò)50%患者肌酐水平處于正常狀態(tài)，因此仍需要尋找可靠、有效的腎損傷標(biāo)志物來(lái)評(píng)估CKD患者疾病的發(fā)生發(fā)展情況。雖然有很多血清指標(biāo)可反映CKD的腎損傷程度，但其臨床價(jià)值仍未得到充分確證，如Klotho 蛋白主要在腎臟生成和代謝，腎臟結(jié)構(gòu)功能的改變均可影響Klotho的表達(dá)[5,6]，人附睪蛋白4(human epididymis protein，HE4)可在人腎臟纖維化狀態(tài)中高表達(dá)，通過(guò)抑制蛋白酶而調(diào)節(jié)腎纖維化組織重塑過(guò)程[7]，尿調(diào)節(jié)素(uromodulin，UMOD)作為T-H 糖蛋白，其水平變化與CKD 有關(guān)[8]。目前關(guān)于血清Klotho，HE4，UMOD表達(dá)水平與CKD的預(yù)后關(guān)系報(bào)道尚不多見(jiàn)，因此本文將通過(guò)實(shí)例進(jìn)行探討，從而為臨床診治提供參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2017年4月～2019年4月期間收治的120例CKD患者，CKD患者病程4～15年，其中男性72例，女性48例，年齡57.24±2.34歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）22.05±2.27 kg/m2。選取同時(shí)段于我院體檢中心檢查健康者100例作為對(duì)照組，其中男性65例，女性35例，年齡56.81±2.27歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）22.47±2.34 kg/m2，兩組患者入組前的性別、年齡、BMI比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.580，P=0.446；t=1.376,P=0.170；t=1.347，P=0.179）?；颊呷虢M前均簽署知情同意書(shū)，且該研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)<60 ml/min，CKD 病史不低于6個(gè)月；②具備認(rèn)知、讀寫能力，病歷資料完整，依從研究方案。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有免疫、血液、神經(jīng)系統(tǒng)疾??；②急性腎損傷、腫瘤；③每日糖皮質(zhì)激素用量超過(guò)10mg；④GFR<60 ml/min；⑤胃腸道、肺部、其他軟組織感染。

1.2 儀器與試劑 Klotho，HE4，UMOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)默沙克生物；酶標(biāo)儀采用賽默飛Varioskan LUX；電化學(xué)發(fā)光儀采用Roche E601。

1.3 方法 患者入組后，于隨訪前以及隨訪結(jié)束后清晨空腹抽取外周肘靜脈血約5 ml，3 000r/min 離心10min，取上層血清于-80℃凍存待用。采用賽默飛Varioskan LUX 酶標(biāo)儀測(cè)定血清Klotho,HE4水平，采用羅氏E601 電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)血清UMOD水平。所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以患者隨訪前血清水平均值為臨界值，分為高水平組、低水平組，比較不同組患者預(yù)后情況。

兩組患者均隨訪12個(gè)月，隨訪過(guò)程中均行常規(guī)排毒、降壓等對(duì)癥治療，隨訪前、結(jié)束后計(jì)算GFR值，計(jì)算所有患者GFR 下降幅度的均值，若超過(guò)均值則判為腎功能惡化，若低于均值則判為腎功能穩(wěn)定[9]。若隨訪12個(gè)月內(nèi)患者死亡，則提前終止隨訪，以死亡前的隨訪結(jié)果為最終結(jié)果，并判定為惡化。隨訪結(jié)束共有45例患者死亡，11例患者出現(xiàn)GFR 下降幅度超過(guò)均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件分析所有數(shù)據(jù)，其中獨(dú)立樣本計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。指標(biāo)間相關(guān)性評(píng)估采用Pearson 相關(guān)性分析，用KaplanMeier 生存分析血清因子與預(yù)后的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組血清Klotho，HE4，UMOD以及GFR水平 見(jiàn)表1。研究組血清Klotho，GFR和UMOD 顯著低于對(duì)照組，HE4水平顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

表1 研究組和對(duì)照組血清Klotho，HE4，UMOD 以及GFR水平比較（±s）

表1 研究組和對(duì)照組血清Klotho，HE4，UMOD 以及GFR水平比較（±s）

項(xiàng)目 研究組(n=120)對(duì)照組(n=100) t P Klotho（ng/ml） 2.55±0.48 8.17±2.46 22.492 <0.001 HE4（pmol/L） 342.45±86.35 72.53±18.45 33.341 <0.001 UMOD（ng/ml） 59.62±10.53 129.35±27.85 23.668 <0.001 GFR（ml/min） 39.45±5.53 109.35±10.89 58.235 <0.001

2.2 血清Klotho，HE4，UMOD 與GFR的關(guān)系 對(duì)患者血清Klotho，HE4，UMOD 與GFR 進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Klotho，UMOD 與GFR呈正相關(guān)性，r=0.682，0.582，HE4與GFR呈負(fù)相關(guān)性，r=0.627，均P＜0.001。

2.3 惡性組、穩(wěn)定組患者血清Klotho，HE4，UMOD變化程度 見(jiàn)表2。隨訪結(jié)束時(shí)血清Klotho，UMOD水平明顯低于隨訪前，HE4水平明顯高于隨訪前，惡性組患者的變化幅度均明顯高于穩(wěn)定組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。

2.4 不同血清水平患者的預(yù)后情況比較 見(jiàn)表3。隨訪12個(gè)月死亡45例（37.50%），不同血清因子水平組患者死亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。Kaplan-Meier曲線發(fā)現(xiàn)高Klotho，UMOD水平組不良腎臟預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)低于低Klotho，UMOD水平組，高HE4水平組不良腎臟預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)高于低HE4水平組，見(jiàn)圖1～3。

表2 惡性組、穩(wěn)定組患者血清Klotho，HE4，UMOD 變化程度比較（±s）

表2 惡性組、穩(wěn)定組患者血清Klotho，HE4，UMOD 變化程度比較（±s）

項(xiàng)目 惡性組(n=56) 穩(wěn)定組(n=64) t P Klotho（ng/ml）-0.95±0.27-0.57±0.16 9.212 <0.001 HE4（pmol/L） 122.25±28.43 72.34±16.45 11.554 <0.001 UMOD（ng/ml）-9.56±2.34-4.64±1.56 13.351 <0.001

表3 血清Klotho，HE4，UMOD水平與患者預(yù)后情況比較（±s）

表3 血清Klotho，HE4，UMOD水平與患者預(yù)后情況比較（±s）

血清因子組別 n 生存 死亡 χ2 P Klotho 高水平 63 45 18 4.511 0.034低水平 57 30 27 HE4 高水平 66 36 30 3.960 0.047低水平 54 39 15 UMOD 高水平 62 46 16 7.484 0.006低水平 58 29 29

圖1 Kaplan-Meiser曲線分析不同Klotho表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 Kaplan-Meiser曲線分析不同HE4表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

圖3 Kaplan-Meiser曲線分析不同UMOD表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

隨著人口老齡化以及生活習(xí)慣的改變，CKD 已成為臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，我國(guó)CKD患病率約為10.8%，其中64歲以上人群發(fā)病率23.4%～35.8%[3]。目前尚無(wú)有效的防治手段，因此早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)以及預(yù)后評(píng)估對(duì)于提高CKD的存活率至關(guān)重要，同時(shí)開(kāi)展針對(duì)預(yù)后的生物標(biāo)志物研究尤為迫切。2012年全球改善腎臟病預(yù)后組織指南推薦通過(guò)計(jì)算GFR評(píng)估腎功能，但越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常、貧血、腦卒中、冠心病、衰老等均可降低GFR，從而影響評(píng)估準(zhǔn)確性，造成假陽(yáng)性結(jié)果[10-11]。Klotho是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腎臟保護(hù)因子，其血清水平的降低與腎臟損傷的程度密切關(guān)聯(lián)。此外，分子遺傳學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)UMOD 基因突變可導(dǎo)致合成后的尿調(diào)節(jié)素多肽鏈?zhǔn)フ_的折疊能力，沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無(wú)法合成具有調(diào)節(jié)功能的尿調(diào)節(jié)素，同時(shí)尿調(diào)節(jié)素異常沉積可加速腎小管細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎單位喪失和引起腎衰竭[12]。HE4是WAP-4 二硫化物核心結(jié)構(gòu)域2 基因編碼的產(chǎn)物，可通過(guò)編碼絲氨酸蛋白激酶抑制劑而抑制腎臟纖維化，延緩CKD 進(jìn)展[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)研究組患者血清Klotho，GFR，UMOD顯著低于對(duì)照組，且通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析顯示Klotho，UMOD 與GFR 呈正相關(guān)性，HE4 與GFR呈負(fù)相關(guān)性，表明Klotho，GFR，UMOD 均可評(píng)估CKD患者腎功能狀態(tài)。楊曉霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)外周血中HE4水平可隨著CKD患者腎功能的下降而上升，且與GFR 呈負(fù)相關(guān)性，與本次研究結(jié)果相近，表明HE4 可能作為CKD 進(jìn)展的血清生物學(xué)標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)CKD患者的預(yù)后情況。QIAN 等[15]研究發(fā)現(xiàn)CKD患者的血清Klotho 下降幅度越大，患者腎功能狀態(tài)越差，則隨訪期間腎臟替代治療風(fēng)險(xiǎn)越高，這與本研究結(jié)果一致。Klotho的降低可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及凋亡等因素?fù)p傷腎臟功能，加重疾病進(jìn)展[16]，血清Klotho水平降低幅度與腎功能的惡化程度相關(guān)，故而惡化組患者下降幅度明顯高于穩(wěn)定組患者。

本研究中120例受試者隨訪12個(gè)月后死亡45例（37.50%），且通過(guò)Kaplan-Meier曲線分析發(fā)現(xiàn)低Klotho，UMOD水平或者高HE4水平患者的預(yù)后較差，死亡風(fēng)險(xiǎn)較高，正如李莎莎等[16]報(bào)道認(rèn)為血清Klotho的降低不僅僅與腎臟損傷程度關(guān)聯(lián)，同時(shí)通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間隨訪發(fā)現(xiàn)其可增加CKD患者進(jìn)展至終末期腎臟病風(fēng)險(xiǎn)和死亡風(fēng)險(xiǎn)。Klotho 功能多樣，可通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于腎臟，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化以及抑制腎臟器官纖維化的作用，如Klotho 可抑制腎臟上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化引起的腎間質(zhì)纖維化，以及抑制組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞凋亡。LIU 等[17]研究發(fā)現(xiàn)Klotho 通過(guò)調(diào)控核因子κB 通路抑制炎性反應(yīng)，從而干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，Wnt 信號(hào)通路，抑制腎間質(zhì)纖維化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。UMOD 廣泛存在于尿液中，具有抗菌作用[18]。高UMOD 排泄導(dǎo)致機(jī)體血清水平較低，可激活機(jī)體免疫功能，或者大量進(jìn)入組織間質(zhì)后，特別是受損傷的腎小管，與嗜中性白細(xì)胞結(jié)合而促進(jìn)IL-8的合成，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-1β，TNF-α，可增加淋巴細(xì)胞表面IL-2 受體與HLA Ⅱ類分子的表達(dá)等，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起慢性腎病的惡化，影響CKD患者的預(yù)后[19]。楊麗霞等[14,20]認(rèn)為HE4是α 平滑肌動(dòng)蛋白的靶點(diǎn)，可在腎臟肌肉成纖維細(xì)胞中大量表達(dá)，在各種CKD患者血清中處于高表達(dá)狀態(tài)，且與腎間質(zhì)纖維化正相關(guān)。HE4 可抑制金屬基質(zhì)蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等激酶活性，從而抑制膠原蛋白I的降解，使得I型膠原蛋白大量沉積于腎臟，從而引起腎臟纖維化，加速CKD 進(jìn)展和腎功能的惡化，故而本次研究發(fā)現(xiàn)血清低HE4水平患者死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。血清學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于臨床仍存在一定局限性，容易受到多種因素的干擾（炎癥、氧化應(yīng)激、高磷血癥等），同時(shí)腎臟以外的其他器官也可分泌血清因子，如血管、腦組織、甲狀旁腺等組織器官可分泌Klotho，因此在實(shí)際腎臟功能以及預(yù)后評(píng)估過(guò)程中需結(jié)合多種指標(biāo)共同檢測(cè)，從而提高評(píng)估效能。

綜上所述，Klotho，HE4，UMOD 均在慢性腎病患者血清中異常表達(dá)，其中血清Klotho，UMOD水平降低以及HE4水平增加可增加腎功能惡化風(fēng)險(xiǎn)，三種血清因子可為預(yù)后評(píng)估提供參考價(jià)值。