何 進，張 艷，申嫻娟，鞠少卿（.杭州余杭嘉木護理院,杭州 30000；2.南通大學附屬醫(yī)院a.醫(yī)學檢驗中心;b.臨床醫(yī)學研究中心,江蘇南通 22600）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是第二常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。即使最近的治療方案有了進步，患者通常也會產(chǎn)生耐藥性并復(fù)發(fā)[2]。對傳統(tǒng)治療方法難以適應(yīng)的患者預(yù)后較差。目前正在努力尋找新的治療策略以及預(yù)測MM 耐藥和預(yù)后的生物標志物[3-4]。

程序性死亡配體1（programmed deathligand 1，PD-L1），也被稱為B7-H1 和CD274，是一種細胞表面糖蛋白，與T淋巴細胞上的受體程序性死亡-1（PD-1）結(jié)合，通常涉及細胞暴露于長時間的抗原刺激時，免疫反應(yīng)終止，免疫衰竭[5]。在抗原呈遞細胞、血管內(nèi)皮細胞、胰島細胞以及免疫特異性位點（胎盤、睪丸及眼睛）上低表達，在大量惡性腫瘤中也有表達[6]。PD-1的另一個配體PD-L2的表達受到更多的限制，活化后可在樹突狀細胞和巨噬細胞上發(fā)現(xiàn)[7]。

PD-1 和PD-L1 阻斷抗體是一種很有前途的新型免疫治療策略。在MM 中定位PD-1/PD-L1 軸的相關(guān)性已在臨床前模型中得到證實，兩種主要的PD-1抑制劑納武單抗（nivolumab）和派姆單抗（pembrolizumab）以及PD-L1抑制劑度伐單抗（durvalumab）在MM 中被研究[8]。ROSSILLE 等[9]人最近發(fā)現(xiàn)，血液中可溶性PD-L1（sPD-L1）濃度可以預(yù)測彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）患者的總體生存期和治療反應(yīng)。目前關(guān)于sPD-L1 在MM 中的臨床意義尚未十分清楚。本研究旨在檢測sPD-L1 在MM患者中的表達情況，并探究sPD-L1水平在疾病輔助診斷及預(yù)測治療反應(yīng)中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集 2017年10月～2019年04月期間，由南通大學附屬醫(yī)院診斷為多發(fā)性骨髓瘤并且未接受治療的患者65例，其中女性29例，男性36例，年齡16～85歲，平均年齡65±11歲。65例同時期健康對照者作為對照。健康組年齡20～78歲，平均年齡58±8歲。MM的診斷、分期及風險狀態(tài)均按照美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南（NCCN）（2015年第3版，2017年第3版）。本研究經(jīng)南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，且所有受試的患者及健康體檢者均知情同意。

1.2 儀器與試劑 sPD-L1檢測試劑盒（CSB-E13644h）購于武漢華美生物工程有限公司。血清LDH濃度用日立7600-020 全自動生化儀檢測；β2M，κ 鏈和λ 鏈濃度用AXSYM 全自動免疫分析儀檢測。

1.3 方法

1.3.1 血清標本采集與處理：用含有分離膠的真空采血管采集MM患者與健康供者外周血，室溫4 000 r/min 離心8 min 分離血漿，分裝于1.5 ml RNase-free的EP 管中置-80℃長期保存。

1.3.2 ELISA檢測sPD-L1：每孔加入100 μl 樣品或者標準品，37℃孵育2 h；去除孔內(nèi)液體不洗，每孔添加100 μl 生物素標記抗體，37℃孵育1 h；洗滌3次，每孔添加100 μl 親和素標記的過氧化物酶，37℃ 孵育1 h；洗滌5次，加入90 μl TMB，37℃避光反應(yīng)30 min；加入50 μl 終止液，450 nm 波長下讀數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 軟件18.0 和Graphpad Prism 6.0 軟件進行分析及繪圖。計量資料以中位數(shù)（四分位間）[M（P25，P75）]表示；組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；ROC曲線評估各指標單獨及聯(lián)合檢測對MM的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MM患者sPD-L1的表達水平 見圖1。ELISA檢測MM患者sPD-L1表達水平。結(jié)果顯示，MM患者組和健康對照組MM患者sPD-L1表達水平分別為1.330（0.482，3.000）ng/ml 和0.310（0.280，0.360）ng/ml，MM患者sPD-L1表達水平顯著高于健康對照組（P<0.000 1）。

圖1 MM患者及健康對照者sPD-L1表達水平（ng/ml）

2.2 MM患者sPD-L1 與MM 臨床分期的關(guān)系 根據(jù)以下分期系統(tǒng)對本研究中65例MM患者進行了分期：Durie-Salmon（DS），國際分期系統(tǒng)（ISS）。然后，根據(jù)疾病分期對MM患者sPD-L1水平進行分析，發(fā)現(xiàn)與DS-I期相比，DS-II期和DS-III期患者sPD-L1表達水平無顯著差異（P>0.05），圖2A。ISS-II期患者sPD-L1表達水平高于ISS-I期，ISS-III期患者sPD-L1水平高于ISS-II期患者（P<0.05），ISS-I期和ISS-III期之間無顯著差異（P>0.05），圖2B。以上結(jié)果表明MM患者sPD-L1水平可能對MM 疾病分期具有一定的臨床價值。

圖2 sPD-L1 與MM 臨床分期的關(guān)系

2.3 MM患者sPD-L1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。將患者sPD-L1表達水平與臨床病理參數(shù)相關(guān)聯(lián)。評估sPD-L1表達水平與性別、年齡、M 蛋白、β2M，輕鏈、總蛋白和LDH 之間的關(guān)系。結(jié)果顯示sPD-L1表達水平與β2M（P=0.033）相關(guān)。而性別、年齡、M 蛋白、總蛋白、輕鏈和LDH 與sPD-L1表達水平不相關(guān)（P>0.05）。

表1 sPD-L1 與MM患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[M(P25，P75)]

2.3 sPD-L1 對MM的診斷效能評價 見圖3。根據(jù)65例MM患者和45例健康對照sPD-L1，β2M，λ輕鏈和κ輕鏈的表達水平，繪制受試者工作曲線（ROC曲線），并以曲線下面積（AUC）評價診斷效能。結(jié)果顯示，sPD-L1的AUC為0.789（95% CI：0.705～0.873）高于β2M（AUC：0.777；95% CI：0.697～0.856），λ輕鏈（AUC：0.698；95% CI：0.599～0.796）和κ輕鏈（AUC：0.770；95% CI：0.688～0.852）。提示sPD-L1 作為MM 輔助診斷標志物具有較好的診斷效能。

圖3 ROC曲線評價各指標的診斷效能

2.4 sPD-L1，β2M 及輕鏈聯(lián)合檢測對MM的診斷價值 見表2。比較MM 和健康對照者中各指標的靈敏度、特異度和準確率。數(shù)據(jù)顯示sPD-L1的靈敏度最高（83.1%），而λ輕鏈的特異度最高（84.6%）。將兩種指標聯(lián)合檢測時，發(fā)現(xiàn)sPD-L1 和β2M組合的靈敏度最高（96.9%）。上述結(jié)果表明sPD-L1 與λ輕鏈，β2M 單獨或者聯(lián)合應(yīng)用可用于MM 輔助診斷。

3 討論

近年來，PD-1 和PD-L1 在許多疾病中的表達及作用被廣泛研究[10-11]。許多學者發(fā)現(xiàn)PD-L1 在MM患者骨髓瘤漿細胞上過表達，但在健康供者的正常漿細胞上不表達，MM 細胞表面PD-L1表達高，骨髓瘤細胞上的PD-L1 與T細胞上的PD-1 直接相互作用，誘導(dǎo)其對抗骨髓瘤化療產(chǎn)生耐藥性[12]。

DHODAPKAR 等[13]報道了PD-L1的表達與臨床MM的風險增加之間的相關(guān)性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，MM患者的sPD-L1水平明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)健康獻血者的血清sPD-L1濃度隨年齡增長而增加，提示循環(huán)中的sPD-L1水平與個體免疫系統(tǒng)的健康有關(guān)[14]，因此，sPD-L1 可能在調(diào)節(jié)免疫活動中發(fā)揮重要作用。此外，在MM患者中，血清sPD-L1水平與β2M 相關(guān)，而與其他臨床特征無關(guān)。在sPD-L1 與MM 分期的相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)ISS 分期較高級別的MM病人其sPD-L1的表達水平也相應(yīng)較高，提示其與MM的惡性進程有一定的關(guān)系。WANG 等[15]發(fā)現(xiàn)血清sPD-L1水平與MM 預(yù)后的關(guān)系，包括治療反應(yīng)和疾病進展。尚不清楚sPD-L1水平升高導(dǎo)致MM患者預(yù)后不良的機制，但可能的解釋是除了抑制腫瘤特異性CTL 細胞外，PD-L1 與PD-1 結(jié)合可通過Akt 信號通路誘導(dǎo)MM 細胞產(chǎn)生耐藥性[16]。將PD-1 抑制劑與免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合應(yīng)用于MM的臨床試驗獲得了一定的效果，然而，關(guān)于這些組合的安全性的擔憂已經(jīng)被提出，一些臨床試驗已經(jīng)被暫?；驍R置，藥物調(diào)節(jié)PD-L1的表達可能是治療MM的新途徑[17]。上述結(jié)果提示PD-L1是MM 治療的潛在靶標。

我們通過ROC分析，發(fā)現(xiàn)sPD-L1的AUC 高于β2M，λ輕鏈和κ輕鏈，且診斷靈敏度最高，聯(lián)合λ輕鏈，β2M 后提高了其特異度，提示sPD-L1 可能是潛在的MM 輔助診斷標志物。當然，我們的研究樣本量相對較小且來自于單中心，未來的研究應(yīng)該再收集不同治療方案的患者樣本，以驗證sPD-L1水平與臨床資料的相關(guān)性，MM 中PD-L1的作用機制仍需進一步探索。

綜上所述，sPD-L1 在MM患者中的表達高于健康人群，在MM 輔助診斷和疾病分期方面有一定的臨床意義。sPD-L1 診斷價值優(yōu)于β2M，λ輕鏈和κ輕鏈，多指標聯(lián)合檢測可提高MM患者的診斷效能，提示sPD-L1 可能是MM 診斷的潛在生物指標。