賈妙妙，王國康，李 麗，王紅琳，羅青平，邵華斌，曾 馳，溫國元* (1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 43003；.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室/湖北省畜禽病原微生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，湖北 武漢，430064)

NP蛋白是含量最為豐富和保守性最高的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其基因全長約為1.7 kb，開放閱讀框長度1.47 kb，共編碼489個氨基酸，相對分子質(zhì)量為53 kDa。NP與L和P蛋白相互協(xié)作，調(diào)控病毒基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[14]。NP蛋白的N端結(jié)合RNA，高度保守，其C端含有磷酸化位點(diǎn)和抗原決定簇位點(diǎn)。NP蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，但不具有免疫保護(hù)作用[15]。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)純化NDV NP蛋白，以其為包被抗原，建立基于NP蛋白的NDV間接ELISA抗體檢測方法，進(jìn)一步分析其敏感性、特異性、重復(fù)性及其與HI檢測方法的符合率，旨在為該方法的臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、血清和載體NDV LaSota株和6種禽類病原的陽性血清，包括NDV、H9亞型禽流感病毒(AIV)、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽大腸桿菌和沙門菌，均由本實驗室保存。30份NDV陰性血清采集自1月齡SPF雞。200份雞血清樣品采集自湖北、山東、河南和江蘇省養(yǎng)殖場。原核表達(dá)宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)和表達(dá)質(zhì)粒pET-30a購自德泰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑病毒RNA提取、DNA回收和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；RT-PCR反應(yīng)試劑、T4DNA連接酶和Taq DNA聚合酶購自寶生物工程有限公司；Ni-IDA瓊脂糖凝膠購自德泰生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG購自北京索萊寶科技有限公司；酶標(biāo)板購自康寧生命科學(xué)有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級。

1.3 NP蛋白的表達(dá)與純化參照病毒RNA提取試劑盒的操作說明書，對感染NDV LaSota株的雞胚尿囊液進(jìn)行病毒RNA的提取，采用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得NDV LaSota株的NP基因。將純化的PCR產(chǎn)物通過酶切連接的方式連入pET-30a質(zhì)粒中，經(jīng)測序鑒定正確后，獲得重組質(zhì)粒pET-NP。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單菌落置37℃培養(yǎng)，待其生長至對數(shù)期時加入0.2 mmol/L IPTG。置于15℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h后，離心收集菌體。以蛋白重懸緩沖液重懸菌體沉淀，超聲破碎。離心收集沉淀，加入8 mol/L尿素使其變性，采用Ni-IDA親和層析法，對變性蛋白進(jìn)行純化并復(fù)性，TE緩沖液透析。以SDS-PAGE和Western blot方法對純化蛋白進(jìn)行鑒定。鑒定正確的NP蛋白以Bradford法定量后保存至-80℃。

1.4 NP蛋白的Western blot檢測純化的NP蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂乳封閉2 h，加入NDV陽性血清(稀釋度為1∶250)，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG(1∶5 000)，37℃作用1 h，PBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，并拍照記錄分析。

1.5 NDV NP蛋白間接ELISA抗體檢測方法將純化的NP蛋白以包被緩沖液適當(dāng)稀釋，包被于酶標(biāo)板中(100 μL/孔)，4℃過夜，PBST洗3次，3 min/次；加入封閉液(200 μL/孔)，37℃溫育2 h，洗滌3次；用1%的脫脂乳稀釋待檢血清，加至酶標(biāo)板(100 μL/孔)，37℃溫育1 h，洗滌3次；加入1%脫脂乳稀釋的HRP標(biāo)記羊抗雞IgG，37℃溫育1 h，洗滌3次,加底物,加入TMB顯色液(100 μL/孔)，避光37℃溫育15 min后，加入終止液終止反應(yīng)；以酶標(biāo)儀測定各孔的D630值。

1.6 NDV NP蛋白間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

該模塊在市場上已有許多成熟的系統(tǒng)，需要從系統(tǒng)技術(shù)先進(jìn)性、可擴(kuò)展性、需求符合度等方面對當(dāng)前市場上先進(jìn)的圖書館自動化管理系統(tǒng)進(jìn)行評估，對候選產(chǎn)品進(jìn)行測試，確保系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行、持續(xù)更新和服務(wù)優(yōu)化。

1.6.1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 按方陣滴定法進(jìn)行，用包被液將NP蛋白按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋，每孔100 μL，4℃過夜；陽性血清和陰性血清分別作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200稀釋，每孔100 μL，每孔重復(fù)3次，進(jìn)行間接ELISA試驗，測定每孔的D630值，計算相同稀釋度的陽性血清和陰性血清孔之間D630值的比值(P/N值)，選擇P/N值最大孔的稀釋倍數(shù)作為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度。

1.6.2包被條件的確定 將剛加入包被蛋白的酶標(biāo)板分別置于37℃ 2 h、4℃過夜和37℃2 h+4℃過夜3種條件下作用，對NDV陰性、陽性血清進(jìn)行ELISA檢測，每個樣品重復(fù)3次，測定各孔的D630值，比較P/N值，確定最佳包被條件。

1.6.3封閉液的確定 選用分別含有2%BSA、2%明膠和5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液作為封閉液，對NP蛋白進(jìn)行稀釋，并包被酶標(biāo)板，進(jìn)行NDV陰性和陽性血清的ELISA檢測，比較P/N值，確定最佳封閉液。

1.6.4樣品稀釋液的確定 分別選用1×PBST和1%脫脂乳、1%BSA、2%脫脂乳、2%BSA、5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液作為樣品稀釋液，進(jìn)行NDV陰性和陽性血清的ELISA檢測，比較P/N值，確定最佳的樣品稀釋液。

1.6.5血清最佳結(jié)合時間的確定 對NDV陰性和陽性血清進(jìn)行ELISA檢測，血清溫育時間分別為30、45、60和90 min，測定各孔D630值，比較P/N值，確定最佳血清溫育時間。

1.6.6二抗最佳稀釋度及孵育時間的確定 按方陣滴定法進(jìn)行，對NDV陰性和陽性血清進(jìn)行ELISA檢測，二抗的稀釋度分別為1∶2 500、1∶5 000、1∶7 500和1∶10 000，每個稀釋度分別于37℃溫育30、45和60 min，測定各孔D630值，比較P/N值，確定二抗最佳稀釋度及溫育時間。

1.6.7顯色時間的確定 對NDV陰性和陽性血清進(jìn)行ELISA檢測，加入TMB顯色液后，分別于37℃避光溫育5,10和15 min，測定D630值，計算P/N值，確定底物最佳作用時間。

2 結(jié)果

2.1 NDV NP蛋白的表達(dá)與純化以NDV LaSota株基因組RNA為模板，擴(kuò)增獲得了NP基因，將其插入到表達(dá)載體pET-30a。鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-NP轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行包涵體的變性、親和層析純化、復(fù)性。對復(fù)性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(圖1)，只在約50 kDa處出現(xiàn)1條蛋白條帶，與預(yù)期NP蛋白大小相符。進(jìn)一步以Western blot方法對目的蛋白進(jìn)行鑒定，以NDV陽性血清為一抗進(jìn)行反應(yīng)，同樣在約50 kDa 處出現(xiàn)1條單一的反應(yīng)條帶(圖2)。通過原核表達(dá)純化的方法，成功獲得了純度較高的NP蛋白。采用Bradford法測得NP蛋白的質(zhì)量濃度為0.54 g/L。

M.蛋白Marker；1.純化NP蛋白

M.蛋白Marker；1.純化NP蛋白

2.2 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果為：NP蛋白包被質(zhì)量濃度為0.675 mg/L，包被條件為4℃過夜，封閉液為含5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液，樣品稀釋液為5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液，被檢血清稀釋度為1∶200，血清溫育時間為30 min，二抗稀釋度為1∶2 500，二抗溫育時間為60 min，顯色時間為15 min。以確定的最優(yōu)反應(yīng)條件為參數(shù)，建立NDV間接ELISA抗體檢測方法。

圖3 30份NDV陰性血清的NDV間接ELISA檢測

2.4 間接ELISA方法的特異性試驗以建立的間接ELISA方法對H9亞型AIV、ALV-J、IBV、雞大腸桿菌和沙門菌等5種禽類病原的陽性血清進(jìn)行檢測(表1)。結(jié)果顯示，對5種陽性血清檢測的D630值均小于0.164，未發(fā)生交叉反應(yīng)。表明該間接ELISA檢測方法具有良好的特異性。

表1 NDV間接ELISA方法的特異性試驗

2.5 間接ELISA方法的敏感性試驗將NDV陽性血清從1∶100開始，2倍梯度稀釋至1∶25 600。將稀釋后的陽性血清進(jìn)行間接ELISA檢測，同時通過HI試驗測定該血清的HI效價(圖4)。結(jié)果顯示，NDV陽性血清檢測為陽性的最低稀釋倍數(shù)為1∶6 400，而通過HI試驗測得該血清的HI效價為1∶128。表明檢測ELISA方法的檢測靈敏度為HI方法的50倍，具有較高的檢測敏感性。

圖4 NDV間接ELISA方法靈敏度檢測結(jié)果

2.6 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗隨機(jī)選取6份NDV陽性血清進(jìn)行間接ELISA檢測方法的組間重復(fù)性試驗(表2)。結(jié)果顯示4次組間重復(fù)試驗的檢測變異系數(shù)范圍為1.65%～5.73%，均小于6.00%.表明該方法具有良好的檢測重復(fù)性。

表2 NDV間接ELISA方法組間重復(fù)性試驗

2.7 間接ELISA方法的臨床樣品檢測對200份臨床血清樣本同時進(jìn)行NDV間接ELISA抗體和HI抗體檢測(表3)。結(jié)果顯示，間接ELISA檢測的陽性數(shù)為196份，HI檢測的陽性數(shù)為190份。與HI方法相比，間接ELISA方法的符合率為97%(190+4=194,194/196=97%)，檢測敏感性為100%(190/190=100%)，檢測特異性為40%(4/10=40%)。

表3 NDV間接ELISA方法和HI方法的臨床樣品檢測符合率

3 討論

目前，已有的 NDV ELISA抗體檢測方法主要是以滅活的NDV全病毒、原核表達(dá)的HN蛋白和HN特異性多肽為固相包被物[16-18]。滅活全病毒的制備成本低、且易于純化，但其具有大量的抗原決定簇，可能會與禽血清中的非特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。HN蛋白具有較強(qiáng)的構(gòu)象依賴性，其原核表達(dá)產(chǎn)物會影響到其免疫反應(yīng)性，進(jìn)而影響檢測方法的靈敏度[19]。P蛋白是6種蛋白中變化最大的一種，因此以其為包被抗原的ELISA可能具有較低的特異性[20]。在NDV的6個結(jié)構(gòu)蛋白中，NP蛋白是含量最高和最為保守的，同時也具有較強(qiáng)的免疫原性[21]。因此，該蛋白可作為NDV間接ELISA抗體檢測方法的優(yōu)選包被蛋白。

本研究采用原核表達(dá)純化的方式，獲得了純化的NDV LaSota株NP蛋白。試驗中表達(dá)的NP蛋白大部分以包涵體形式存在，可能是由于蛋白表達(dá)量過高，其分子間的作用力增強(qiáng)，聚合趨向增大，形成聚合體，產(chǎn)生不溶性的蛋白沉淀，即包涵體。通過尿素變性、復(fù)性的方法，成功獲得了可溶性的NP蛋白，且純度較高。研究表明，以大腸桿菌表達(dá)的蛋白作為抗原檢測血清抗體，容易出現(xiàn)假陽性、陽性樣品吸光值偏高等問題，其主要原因是純化蛋白中存在大腸桿菌菌體成分污染，其與被檢血清中非特異性的大腸桿菌抗體發(fā)生反應(yīng)。對包括大腸桿菌在內(nèi)的5種其他禽類病原的陽性血清進(jìn)行NDV間接ELISA方法檢測，未發(fā)生交叉反應(yīng)，表明NP蛋白的純度較高，以其為包被蛋白建立的ELISA方法特異性良好。

HI方法是目前臨床使用較為普遍的NDV抗體檢測方法[22]。與HI方法相比，本研究建立的NDV間接ELISA檢測方法敏感性是HI方法的50倍。對200份臨床血清樣品進(jìn)行檢測，二者的檢測符合率為97%，檢測敏感性為100%，而檢測特異性僅為40%(4/10)。其原因可能與ELISA方法的敏感性高有關(guān)，后續(xù)需要檢測更多的陰性樣品，以進(jìn)一步驗證其檢測特異性。

綜上所述，本研究通過原核表達(dá)純化的方法，獲得純化的NDV NP蛋白，以其為包被蛋白，通過檢測條件的優(yōu)化，建立NDV間接ELISA抗體檢測方法。該方法具有良好的檢測敏感性、特異性和重復(fù)性。臨床樣品檢測結(jié)果表明，該方法與HI方法具有較高的檢測符合率，可應(yīng)用于臨床血清樣品的NDV抗體檢測。