賀尚文，侯思魯，李秋月，張 慧，徐媛媛，劉曉曄，董 虹* (.北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京02206;2.北京大學(xué)，北京 0087)

畜牧養(yǎng)殖業(yè)中常用作抗生素替代物的飼料添加劑主要包括益生菌、植物提取物、中草藥、天然多糖和天然抗菌肽等[1-2]。其中中草藥因其具有資源豐富、功能多樣、毒性低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑[3]。根據(jù)中草藥添加劑的特點(diǎn)和應(yīng)用效果大致可分為免疫增強(qiáng)劑如刺五加、菜豆;抗微生物劑連翹、蒲公英;激素樣作用劑甘草、肉桂，増食劑五味子和鼠尾草等[4-5]。黃酮類中藥是中藥有效成分的重要一類，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能，在畜牧業(yè)中也被用作飼料添加劑在豬、反芻動(dòng)物及魚類生產(chǎn)中應(yīng)用，具有開發(fā)前景[6-8]。目前,黃酮類中藥被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗溶血素效果，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌α-溶血素、李斯特菌溶血素及豬鏈球菌溶血素具有較好的抑制效果，主要通過(guò)抑制溶血素基因編碼、基因轉(zhuǎn)錄或直接中和溶血素等途徑抑制其活性。本研究將近年來(lái)對(duì)細(xì)菌溶血素具有良好抑制效果的黃酮類中藥進(jìn)行總結(jié)歸納，為研究抗細(xì)菌溶血素機(jī)制和開發(fā)新型黃酮類中藥飼料添加劑提供參考。

1 溶血素分類概述

溶血素概念是FUSSLE等[9]在1981年研究金黃色葡萄球菌α-毒素作用機(jī)制時(shí)提出的。早期溶血素多根據(jù)其抗原特性進(jìn)行命名，而目前針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的溶血素主要根據(jù)其特性以菌名加溶素后綴(-lysin)進(jìn)行命名[10]。根據(jù)溶血素的作用機(jī)制等不同可將溶血素分為兩大類，即重復(fù)子毒素家族(repeats in toxin family，RTX)和膽固醇依賴細(xì)胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysin family，CDC)[11]，代表性溶血素的主要毒性作用見(jiàn)表1[12-20]。其中,重復(fù)子毒素家族主要為革蘭陰性菌產(chǎn)物，代表性成員為埃希大腸桿菌溶血素(HlyA)，家族中其他溶血素有30%～75%基因序列與HlyA相同[21]。此家族具有9個(gè)串聯(lián)氨基酸重復(fù)出現(xiàn)的特殊分子結(jié)構(gòu)，且它們?cè)诎l(fā)揮致病作用時(shí)離不開Ca2+的幫助，需9肽結(jié)合區(qū)與鈣離子結(jié)合后才能發(fā)揮其毒性[22]。膽固醇依賴細(xì)胞溶素，主要由革蘭陽(yáng)性菌產(chǎn)生，常見(jiàn)家族成員見(jiàn)表1[15]。正如他們的家族名字一樣，此類溶血素在發(fā)揮致病作用時(shí)需要借助靶細(xì)胞膜上的膽固醇。首先與靶細(xì)胞表面的膽固醇受體結(jié)合并通過(guò)復(fù)合變構(gòu)，最終插入細(xì)胞膜中形成寡聚β-桶狀跨膜孔道而達(dá)到致病作用[23]。除此之外還有個(gè)別溶血素未歸到以上兩大家族，如金黃色葡萄球菌α-溶血素(Hla)等。

表1 常見(jiàn)溶血素的毒性作用

2 黃酮類中藥抗溶血素的作用機(jī)制

黃酮類中藥主要為2個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過(guò)中央三碳原子相互連接而成，具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的一系列化合物，多依據(jù)中央三碳鏈的氧化程度及是否成環(huán)和連接B環(huán)位置等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其進(jìn)行分類[24]。黃酮類中藥分布廣泛，是多種經(jīng)典方劑中中草藥的主要活性成分，目前研究表明黃酮類中藥具有抑菌消炎[25]、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷[26]、調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號(hào)通路[27]等多種生物學(xué)活性。除此之外，黃酮類中藥對(duì)細(xì)菌溶血素亦具有很好的抑制效果，主要通過(guò)直接阻止溶血素的生成或中和溶血素兩方面來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)其的抑制效果。

這些黃酮類中藥具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，較復(fù)方中藥而言化學(xué)成分單一且純度較高，可以更好更深入地研究其抑制溶血素的具體機(jī)制，并將功能細(xì)化到結(jié)構(gòu)，為后續(xù)抗毒素中藥篩選提供方向指導(dǎo)。本研究將近幾年來(lái)對(duì)細(xì)菌溶血素具有抑制作用的黃酮類中藥進(jìn)行分類匯總，發(fā)現(xiàn)主要為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類及查爾酮類，且主要對(duì)Hla、單增李斯特菌細(xì)胞溶素(LLO)及豬鏈球菌細(xì)胞溶素(SLY)具有較好的效果。

2.1 黃酮類黃酮類即以2-苯基色原酮為基本母核的一類化合物類，與黃酮醇類的區(qū)別在于基本母核的C3位上無(wú)羥基或其他含氧取代基。常見(jiàn)的有芹菜素、香葉木素、黃芩苷、木蝴蝶素A、黃芩素、白楊素及木犀草素等，這些黃酮類中藥都具有抑制溶血素效果(圖1)。這些化合物分子結(jié)構(gòu)平面性較強(qiáng)、分子排列緊密、分子間引力較大，故而難溶于水，黃酮醇類及查爾酮類亦是如此。在酸堿性方面，黃酮類中藥的酸性強(qiáng)弱與酚羥基的數(shù)目和位置有關(guān)。其中R2及R6位置取代基為羥基時(shí)，受P-Π共軛效應(yīng)影響，酸性強(qiáng)于一般酚羥基，當(dāng)R4位置取代基為酚羥基時(shí)，由于與羰基形成分子內(nèi)氫鍵故酸性弱于一般酚羥基[28]。

1.芹菜素,R1-H,R2-OH,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH；2.香葉木素,R1-H,R2-OCH3,R3-OH,R4-OH,R5-H,R6-OH；3.黃芩苷,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OH,R6-CO(CHOH)4COOH；4.木蝴蝶素A,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OCH3,R6-OH；5.黃芩素,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OH,R6-OH；6.白楊素,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH；7.木犀草素,R1-OH,R2-OH,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH

芹菜素是一種可以從多種中藥，如半枝蓮[29]、女貞子[30]、紫蘇[31]、馬齒莧[32]等中提取的常見(jiàn)的黃酮類中藥。對(duì)于芹菜素的研究前期主要集中在對(duì)癌癥的預(yù)防及治療方面，而近期研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過(guò)抑制hla和agrA基因的轉(zhuǎn)錄降低金黃色葡萄球菌Hla的分泌，來(lái)抑制溶血活性[33-34]。其中hla是Hla的編碼基因，由agrA二元調(diào)控系統(tǒng)正調(diào)節(jié)，兩者在調(diào)節(jié)毒力因子表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[35]。隨后研究發(fā)現(xiàn)在抑制Hla分泌上，噬菌體裂解酶(Lys GH15)與芹菜素聯(lián)合應(yīng)用的效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用芹菜素，它們兩者表現(xiàn)出微弱的協(xié)同作用[36]。這提示黃酮類中藥聯(lián)合療法的潛在價(jià)值。香葉木素也被證明通過(guò)相同的機(jī)制抑制Hla的分泌[37]。

除了可直接通過(guò)降低Hla的表達(dá)來(lái)抑制溶血活性外，一些黃酮類中藥雖不能影響Hla的產(chǎn)生但卻仍以劑量依賴的方式抑制其活性。主要原因是這些黃酮類中藥抑制了Hla七聚體的形成。研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過(guò)與Hla“三角形區(qū)域”殘基Y148、P151和P153結(jié)合，抑制Hla七聚體的形成,繼而對(duì)其活性產(chǎn)生抑制作用，最終阻斷其對(duì)機(jī)體的損害作用[38]。黃芩苷與Hla結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象見(jiàn)圖2。除黃芩苷外，木蝴蝶素A也被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制Hla七聚體的形成影響溶血活性。但其與Hla作用的結(jié)合位點(diǎn)與黃芩苷不同。木蝴蝶素A通過(guò)結(jié)合Hla的Thr11、Thr12、Ile14、Gly15和Lys46殘基，破壞關(guān)鍵的“環(huán)狀”結(jié)構(gòu)進(jìn)而阻止Hla七聚體的形成，抑制溶血活性[39]。木蝴蝶素A與Hla結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象見(jiàn)圖3A，最終結(jié)合位點(diǎn)的靜電勢(shì)見(jiàn)圖3B，其中藍(lán)色為正電荷區(qū)域，紅色為負(fù)電荷區(qū)域，白色為中性區(qū)域。此外以上4種黃酮類化合物均可保護(hù)人肺泡上皮(A549)細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌在共培養(yǎng)系統(tǒng)中引起的損傷。

圖2 黃芩苷與α-溶血素結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象[38]

圖3 木蝴蝶素A與α-溶血素結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象[39]

在研究針對(duì)李斯特菌溶血素的黃酮類中藥時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃芩素及白楊素不抑制LLO的合成，可直接中和單增李斯特菌培養(yǎng)物上清及純化的LLO從而介導(dǎo)成孔活性[40]。木犀草素不抑制LLO編碼基因(hly)的轉(zhuǎn)錄，但可特異性地抑制hly的翻譯，從而降低單增李斯特菌菌體內(nèi)外LLO含量。

2.2 黃酮醇類黃酮醇類中藥對(duì)于Hla、LLO及SLY均有抑制作用。據(jù)報(bào)道，異鼠李素，一種從藥用植物如銀杏[41]、沙棘[42]等中提取分離得到的，同時(shí)也在很多植物的花、葉和果實(shí)中存在的黃酮醇類中藥，通過(guò)下調(diào)RNAⅢ表達(dá)，抑制hla轉(zhuǎn)錄來(lái)達(dá)到抑制Hla分泌的效果，同時(shí)局部異鼠李素處理可保護(hù)免受金黃色葡萄球菌對(duì)A549細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[43-44]。其中RNAⅢ基因是正向調(diào)控Hla的二元調(diào)控系統(tǒng)agr的效應(yīng)因子[35]。研究發(fā)現(xiàn)漆黃素不影響LLO的合成分泌但可通過(guò)抑制LLO與膽固醇的結(jié)合，阻止LLO的寡聚化作用，而降低其成孔活性，從而減少單增李斯特菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[45]。另外，在對(duì)SLY抑制作用的研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮醇類中藥桑色素可抑制SLY的溶血活性，但桑色素本身并不影響SLY的表達(dá)，而是通過(guò)直接中和SLY起到的抑制作用，同時(shí)還可顯著緩解豬鏈球菌介導(dǎo)的宿主細(xì)胞(J774細(xì)胞)損傷[46]。黃酮醇類中藥異鼠李素、漆黃素和桑色素結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

1.異鼠李素,R1-H,R2-OCH3,R3-OH,R4-OH,R5-OH；2.漆黃素,R1-H,R2-OH,R3-OH,R4-H,R5-OH；3.桑色素,R1-OH,R2-H,R3-OH,R4-OH,R5-OH

2.3 二氫黃酮類二氫黃酮類為中央三碳原子C2、C3位雙鍵被還原為單鍵的一類黃酮類中藥[24]。如柚皮素和橙皮素等(圖5)。這類化合物的分子結(jié)構(gòu)為非平面，分子排列不緊密，分子間引力較小,有利于水分子進(jìn)入故而水溶性相對(duì)較大[28]。柚皮素是一種可從化橘紅、枳實(shí)及各種柑橘類水果(如葡萄柚、柚子、橙等)的果皮果肉中得到的二氫黃酮類中藥[47]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)柚皮素對(duì)于金黃色葡萄球菌所致的小鼠肺炎具有較好的療效[48]，隨后張雨[49]在其研究中發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過(guò)抑制hla的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)降低Hla的表達(dá)量，從而抑制溶血活性保護(hù)機(jī)體。此外，柚皮素還可以抑制金黃色葡萄球菌其他外毒素如，SEA、SEB和TSST-1的表達(dá)，并且同樣對(duì)A549細(xì)胞具有保護(hù)作用。橙皮素也被發(fā)現(xiàn)具有抑制Hla的作用，其作用機(jī)制與上述黃酮醇類中藥異鼠李素相同[50]。

圖5 二氫黃酮類中藥結(jié)構(gòu)

2.4 查爾酮類查爾酮類的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是C環(huán)未成環(huán)。其中被大家熟知的如：根皮素和甘草查爾酮E等，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。研究發(fā)現(xiàn)，根皮素與甘草查爾酮E都以與黃酮類中藥芹菜素相同的機(jī)制抑制金黃色葡萄球菌Hla，其中根皮素還可保護(hù)A549細(xì)胞免受金葡菌的損傷[51-52]。除此之外，在根皮素的研究中還發(fā)現(xiàn)其可抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌中的LLO表達(dá)，在研究其機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)根皮素處理并沒(méi)有影響hly轉(zhuǎn)錄，猜測(cè)可能是由于抑制了細(xì)胞質(zhì)中LLO翻譯導(dǎo)致[53]，黃酮類中藥對(duì)溶血素的抑制機(jī)制總結(jié)見(jiàn)表2。

圖6 查爾酮類中藥結(jié)構(gòu)

表2 黃酮類中藥對(duì)溶血素的抑制機(jī)制

3 討論

細(xì)菌溶血素是細(xì)菌致病的重要毒力因子，以溶血素為靶標(biāo)，通過(guò)中和或抑制其分泌，降低細(xì)菌的致病性，隨后調(diào)動(dòng)天然免疫細(xì)胞將細(xì)菌清除，可在保護(hù)機(jī)體的同時(shí)阻止細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。以溶血素為目標(biāo)進(jìn)行干預(yù)，從而達(dá)到抗菌目的是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，也是篩選抗菌藥物的一條新方向。

而目前在抑制細(xì)菌溶血素的研究中，越來(lái)越多的中藥被研究，并發(fā)現(xiàn)具有較好的抑制效果。但中藥成分的復(fù)雜性是研究的一大難題，而中藥單體較中藥而言具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，從而更利于研究。本研究總結(jié)各種結(jié)構(gòu)的黃酮類中藥在抑制溶血素方面所發(fā)揮的作用，看到這類中藥在治療細(xì)菌性疾病中的巨大潛力。我國(guó)中藥資源豐富，黃酮類中藥分布廣泛，以黃酮類結(jié)構(gòu)為導(dǎo)向篩選抗毒素藥物，對(duì)于研發(fā)新型抗菌藥、開發(fā)中藥飼料添加劑具有重大意義。同時(shí)在中藥復(fù)方的研究中，針對(duì)具有抗菌效果的中藥復(fù)方，如白頭翁湯等，或許可通過(guò)增加富含對(duì)溶血素有抑制效果的黃酮類成分的中藥，以優(yōu)化中藥復(fù)方在治療細(xì)菌感染方面的作用。此外這些黃酮類中藥或許在一些由毒素引起的細(xì)菌混合感染中具有潛在作用。由此，在目前研究基礎(chǔ)上繼續(xù)開發(fā)利用黃酮類中藥具有巨大前景。