薛 智，彭 倩，李 璟，繆昌峰

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH) 是臨床常見的一種嚴(yán)重的急性腦血管疾病，多發(fā)生于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、外傷、藥物或其他原因。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性。之前的研究報(bào)道，槲皮素可以抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減少氧化應(yīng)激造成的腦損傷。但是關(guān)于槲皮素在蛛網(wǎng)膜下腔出血早期對(duì)腦損傷的作用目前的研究較少，該研究通過頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH大鼠模型，探討槲皮素對(duì)SAH 24 h后大鼠腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量270～300 g，6～8周齡，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2019-0012，室溫23～25 ℃飼養(yǎng)，食物和水分按時(shí)攝入，晝夜節(jié)律規(guī)律。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為Sham組、SAH組和模型+槲皮素50 mg/kg組(SAH+Que 50 mg/kg)和模型+槲皮素100 mg/kg組(SAH+Que 100 mg/kg)，槲皮素用0.9%氯化鈉溶液溶解，采取灌胃給藥，給藥體積為1 ml，持續(xù)14 d，每組15只，其中5只用于腦水腫檢測(cè)，5只用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，5只用于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2 模型制備

采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH大鼠模型，經(jīng)大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4.0 ml/kg)后，分離頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈和枕動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和距頸動(dòng)脈分叉處5 mm處。用纖芯從頸外動(dòng)脈進(jìn)入，向頸內(nèi)動(dòng)脈插入，入顱內(nèi)直到有明顯抵抗感，再用力向前推3 mm刺破大腦中動(dòng)脈，停留15 s后拔出纖芯并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合消毒。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：① 有明顯的血管刺破感。② 大鼠出現(xiàn)呼吸急促，心率加快癥狀。③ 腦組織剝離后可觀察到明顯的血液散布在腦底和環(huán)池等部位。每組15只大鼠，造模過程中出現(xiàn)動(dòng)物死亡隨機(jī)給予補(bǔ)充。

1.3 試劑與儀器

槲皮素(≥95%)和伊文思藍(lán)均購自美國Sigma公司；TUNEL染色試劑盒、大鼠抗LC3抗體、抗Cleaved caspase-9抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Nrf2抗體、抗HO-1抗體、抗NQO1抗體和GAPDH均購自中國賽默飛世爾公司；DYY-7C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Click-iT?TUNELAlexa 488試劑盒購自上海賽默飛公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1

神經(jīng)功能評(píng)分 在造模后23 h，依據(jù)Garcia神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的自發(fā)活動(dòng)、前爪運(yùn)動(dòng)及力量、四肢自發(fā)運(yùn)動(dòng)、本體感覺、攀爬能力及觸須刺激反應(yīng)等進(jìn)行評(píng)分。

1.4.2

腦組織含水量檢測(cè) 在完成神經(jīng)功能評(píng)分后，采用干濕重法測(cè)定腦組織含水量，動(dòng)物麻醉處死后，去大腦稱重為濕質(zhì)量，在100 ℃恒溫箱干燥烘烤3 d后再次稱重為干質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水量百分比。

1.4.3

EB含量測(cè)定 通過測(cè)定EB外滲來分析血腦屏障通透性。在完成神經(jīng)功能評(píng)分后，取7只大鼠用水合氯醛麻醉，通過尾靜脈注入2% EB(2 ml/kg)，打開胸腔，心內(nèi)灌注0.9%氯化鈉溶液+20 U/ml肝素鈉共300 ml，斷頭取腦，然后將大鼠大腦在10倍體積的50%三氯乙酸溶液中勻漿沉淀蛋白質(zhì)并離心。 上清液用乙醇(1 ∶3)稀釋，并在610 nm處測(cè)量熒光，以測(cè)量EB的吸光度。

1.4.4

免疫熒光染色 在Garcia神經(jīng)功能評(píng)分后麻醉大鼠，并用鹽水和10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注。取出腦，在多聚甲醛中固定24 h，隨后石蠟包埋并切下20 μm厚的切片，對(duì)切片進(jìn)行TUNEL染色。將切片脫石蠟，再水化并在PBS中洗滌兩次。4%(W/V) PFA中固定切片15 min，PBS洗滌后，將切片在室溫下用3% HO孵育15 min，并用含有0.1% Triton X-100的PBS和5%牛血清白蛋白在37 ℃下封閉30 min。將切片分別與Ⅰ抗[1 ∶500稀釋的NeuN(神經(jīng)元標(biāo)記)、LC3]在4 ℃下孵育過夜，PBS中洗滌后，在室溫下與山羊抗兔Alexa Fluor 488 Ⅱ抗孵育1 h。使用ECLPSE 80i(Nikon，日本)顯微鏡拍攝每個(gè)樣品的5個(gè)隨機(jī)視野的圖像。

1.4.5

蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 取腦皮質(zhì)組織100 mg放入試管，剪碎，裂解液充分研磨，冰上裂解1 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)蛋白濃度(Bio-Rad試劑盒)，分別取50 μg蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后(于4%～12%聚丙烯酰胺凝膠電泳)2 h，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別與抗Cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1和NQO1一抗(兔抗鼠，1 ∶1 000)37 ℃搖床孵育2.5 h，PBST洗滌3次，與二抗(羊抗兔,1 ∶2 000)37 ℃搖床孵育0.5 h。PBST洗滌后經(jīng)ECL熒光顯色，SMARTVIEW軟件分析蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織水含量測(cè)定及伊文思藍(lán)滲出測(cè)定結(jié)果

采用Garcia神經(jīng)功能評(píng)分對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定，與Sham組(0.20±0.05)比較，SAH組(5.27±0.35)Garcia神經(jīng)功能評(píng)分增高(

F

=13.31，

t

=4.518,

P

<0.001)，腦組織水含量升高(

F

=26.21，

t

=15.827,

P

<0.001)，伊文思藍(lán)滲出增加(

F

=10.84，

t

=5.275,

P

<0.05)；與SAH組比較，SAH+Que 50 mg/kg組(3.7±0.1)Garcia神經(jīng)功能評(píng)分降低(

F

=13.31，

t

=5.520,

P

<0.05)，腦組織水含量降低(

F

=26.21，

t

=14.963,

P

<0.05)；與SAH組比較，SAH+Que 100 mg/kg組(3.7±0.1)Garcia神經(jīng)功能評(píng)分降低(

F

=13.31，1.8±0.2)(

t

=5.028,

P

<0.01)，腦組織水含量降低(

F

=26.21，

t

=12.430,

P

<0.001)，伊文思藍(lán)滲出減少(

F

=10.84，

t

=4.963,

P

<0.01)。見圖1。

圖1 神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織水含量測(cè)定及伊文思藍(lán)法檢測(cè)血-腦屏障通透性(n=5)A：各組大鼠大腦組織代表圖；B：各組神經(jīng)功能評(píng)分；C：各組腦組織水含量測(cè)定；D：各組伊文思藍(lán)滲出量；1：Sham組；2：SAH組；3：SAH+Que 50 mg/kg組；4：SAH+Que 100 mg/kg組；與Sham組比較: *P<0.05，***P<0.001；與SAH組比較: #P<0.05，##P<0.01

2.2 TUNEL/NeuN雙熒光染色結(jié)果

TUNEL/NeuN雙熒光染色結(jié)果表明，與Sham組比較，SAH組TUNEL/NeuN雙陽性細(xì)胞占NeuN陽性細(xì)胞比例增加(

F

=31.32，

t

=21.729,

P

<0.001)；與SAH組比較，SAH+Que 50 mg/kg組和SAH+Que 100 mg/kg組TUNEL/NeuN雙陽性細(xì)胞占NeuN陽性細(xì)胞比例減少(

F

=31.32，

t

=17.528、19.482, 均

P

<0.05)，且呈現(xiàn)出Que劑量依賴性。見圖2。

圖2 TUNEL/NeuN雙熒光染色結(jié)果(n=5)A：綠色熒光蛋白為TUNEL標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，紅色熒光蛋白為NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元，紅綠混合熒光為TUNEL/NeuN雙標(biāo)記的效果；B：TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)；1：Sham組；2：SAH組；3：SAH+Que 50 mg/kg組；4：SAH+Que 100 mg/kg組；與Sham組比較: ***P<0.001；與SAH組比較: #P<0.05，##P<0.01

2.3 LC3/NEUN雙熒光染色結(jié)果

LC3/NeuN雙熒光染色結(jié)果表明，與Sham組比較，SAH組LC3/NeuN雙陽性細(xì)胞占比增加(

F

=16.64，

t

=6.470,

P

<0.001)；與SAH組比較，SAH+Que 50 mg/kg組和SAH+Que 100 mg/kg組LC3/NeuN雙陽性細(xì)胞占比減少(

F

=16.64，

t

=7.263、8.108, 均

P

<0.05)，且呈現(xiàn)出Que劑量依賴性。見圖3。

圖3 LC3/NEUN雙熒光染色結(jié)果(n=5)A：綠色熒光蛋白為L(zhǎng)C3陽性細(xì)胞，紅色熒光蛋白為NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元，紅綠混合熒光為L(zhǎng)C3/NeuN雙陽性的細(xì)胞；B：LC3陽性細(xì)胞數(shù)；1：Sham組；2：SAH組；3：SAH+Que 50 mg/kg組；4：SAH+Que 100 mg/kg組；與Sham組比較：***P<0.001；與SAH組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明，與Sham組比較，SAH組凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-9和 Bax表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)降低(

F

=19.75，

t

=4.352、4.587、4.269,

P

<0.001)，Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)均降低(

F

=17.32，

t

=4.823、5.285、4.920,

P

<0.001)；與SAH組比較，SAH+Que 50 mg/kg組和SAH+Que 100 mg/kg組Cleaved caspase-9和 Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增高(

F

=21.65，

t

=4.150～6.825, 均

P

<0.05)，Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)均增高(

F

=19.21，

t

=4.050～6.520, 均

P

<0.01)。見圖4。

圖4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)A、B：各相關(guān)蛋白的表達(dá)；1：Sham組；2：SAH組；3：SAH+Que 50 mg/kg 組；4：SAH+Que 100 mg/kg 組；與Sham組比較：***P<0.001；與SAH組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3 討論

SAH引起的廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是SAH后早期腦損傷中的關(guān)鍵部分。該研究表明，與Sham組比較，SAH組神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織水含量均顯著升高，血腦屏障通透性顯著減弱，表明SAH后出現(xiàn)腦水腫、細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能減弱。與SAH組比較，Que干預(yù)后神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織水含量均降低，血腦屏障通透性改善，表面Que改善了SAH后的腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞功能。TUNEL染色中SAH組TUNEL陽性細(xì)胞高于Sham組，但低于Que干預(yù)組，也表明Que可以顯著減少SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

自噬和凋亡信號(hào)通路存在廣泛的聯(lián)系，它們相互作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡。正常水平的自噬是一種通過降解細(xì)胞內(nèi)異常組分以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程，然而過度自噬則引起細(xì)胞自噬性死亡。LC3是細(xì)胞膜表面參與自噬小體形成的蛋白，是自噬過程的標(biāo)志性蛋白，免疫熒光染色結(jié)果顯示，SAH組LC3/NeuN雙陽性細(xì)胞在NeuN陽性細(xì)胞中占比高于Sham組，但低于Que干預(yù)組，表明SAH后神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)過度自噬導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞死亡，Que干預(yù)可以抑制過度自噬導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡。

之前的研究表明，線粒體通路在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷細(xì)胞凋亡中起重要作用，Bcl-2和Bax基因是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控基因，Bcl-2家族包括抗細(xì)胞凋亡的基因(如Bcl-2)和促細(xì)胞凋亡的基因(如Bax)，Bax在線粒體外膜形成同源二聚體從而形成通道，使細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中進(jìn)而激活caspase-9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明，SAH組凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-9和 Bax表達(dá)高于Sham組，但低于Que干預(yù)組，表明SAH通過Bax/caspase-9通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Que干預(yù)通過Bax/caspase-9通路抑制細(xì)胞凋亡。本核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種氧化應(yīng)激過程中的防御性轉(zhuǎn)錄因子，受到刺激時(shí)被激活向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，HO-1和NQO-1是Nrf2的下游分子，激活Nrf2-HO-1/NQO-1通路已被報(bào)道可通過減緩氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。該研究表明，SAH組Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)低于Sham組和Que干預(yù)組，Que可激活被SAH抑制的Nrf2/HO-1通路，提示Nrf2/HO-1通路參與Que發(fā)揮的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。