李 佳，郗玉巧，王少華，楊金亮，楊鐵牛，張永亮，胡啟飛

目前全世界范圍內(nèi)，高發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及致死率的惡性腦膠質(zhì)瘤是成人中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。其治療手段是顯微外科手術(shù)聯(lián)合放化療，但總體預(yù)后仍較差，絕大多數(shù)患者在術(shù)后2年內(nèi)死亡，5年生存率不足5%。因此，腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子作用機制的研究和闡明，成為當(dāng)前治療膠質(zhì)瘤的主要研究方向。而能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力及加速其凋亡的抑癌基因無疑是這方面研究的重點。長鏈非編碼RNA(long non-coding, LncRNA)是一類不具備編碼蛋白功能的RNA分子，近年來文獻報道許多LncRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中參與調(diào)控其增殖、侵襲、凋亡等生物行為 。母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3, MEG3)作為LncRNA 的成員之一，已有文獻報道其具有抑癌功能，在多種惡性腫瘤中出現(xiàn)缺失或表達(dá)水平下降，而腫瘤細(xì)胞中的LncRNA MEG3高表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。但目前LncRNA MEG3對腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能影響報道較少。該研究旨在探討其對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科收集了人正常腦組織細(xì)胞；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫；培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、胰酶消化液均購自美國Hyclone公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及qRT-PCR試劑盒均購自美國 Invitrogen公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體購自北京中杉金橋公司，包括一抗：兔抗人MDM2、 p53，羊抗人GADPH多克隆蛋白抗體；二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG、羊抗兔 IgG；MTT及細(xì)胞凋亡試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；pCI真核表達(dá)載體購自上海艾博思生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1

RNA提取與RT-PCR檢測細(xì)胞中LncRNA MEG3表達(dá)變化 將組織和細(xì)胞勻漿后，根據(jù)試劑盒操作步驟，采用 TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA模板進行PCR 反應(yīng)擴增，LncRNA MEG3引物序列：F：5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′，R：5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′；內(nèi)參GADPH引物序列：F：5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′，R：5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTT-3′。應(yīng)用熒光定量PCR儀7900型軟件進行定量檢測，利用2公式所得到的數(shù)值來衡量LncRNA MEG3 mRNA的表達(dá)強度。

1.2.2

質(zhì)粒載體構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將PCR擴增的LncRNA MEG3 cDNA序列亞克隆到pCI真核表達(dá)載體中，進而構(gòu)建成pCI-MEG3過表達(dá)質(zhì)粒。U251細(xì)胞培養(yǎng)：在DMEM 培養(yǎng)液(含10U/L青霉素、10%滅活的胎牛血清、100 mg/L鏈霉素)中常規(guī)培養(yǎng)，且培養(yǎng)箱為37 ℃恒溫，5% CO的飽和濕度。用0.25%胰酶每2 d消化傳代一次。U251細(xì)胞處于對數(shù)生長期時消化處理并離心(5 min、1 000 r/min)，加入適量DMEM 培養(yǎng)基(僅含胎牛血清、無抗生素)并計數(shù)，在培養(yǎng)瓶中按 5×10/ml密度接種。接種24 h左右待細(xì)胞長至培養(yǎng)板80%以上時進行轉(zhuǎn)染。將U251細(xì)胞隨機分3組，前兩組用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2 000分別轉(zhuǎn)染pCI-MEG3組和pCI組，Control組加入 PBS。經(jīng)過轉(zhuǎn)染48 h后，利用qRT-PCR檢測3組細(xì)胞中 LncRNA MEG3 mRNA的表達(dá)量，方法參照上述1.2.1。

1.2.3

Western blot檢測U251細(xì)胞中LncRNA MEG3相關(guān)蛋白表達(dá)變化 用胰酶消化轉(zhuǎn)染 48 h后的3組U251細(xì)胞，預(yù)冷的PBS輕輕晃動清洗 3次，PBS棄凈，RIPA裂解細(xì)胞，提取3組細(xì)胞總蛋白，并進行蛋白定量(BCA法)。然后根據(jù)SDS-PAGE上樣電泳將3組蛋白轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)處理，并用封閉液(含5%脫脂牛奶的 TBST 溶液)室溫封閉2～3 h，一抗孵育12 h，二抗孵育2 h。按照Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit曝光顯影，使用Syngene Bio Imaging 軟件進行圖像分析。

1.2.4

MTT檢測細(xì)胞生長情況 將轉(zhuǎn)染后的3組U251細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為1×10/孔，進行常規(guī)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)0、12、24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃ 繼續(xù)孵育，4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加入分析純的DMSO 150 μl，放置酶標(biāo)儀振蕩 5 min，用分光光度計測定492 nm下的吸光度值A(chǔ)?？v坐標(biāo)為細(xì)胞存活率，橫坐標(biāo)為時間，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5

細(xì)胞克隆技術(shù)檢測細(xì)胞增殖情況 將轉(zhuǎn)染后的3組U251細(xì)胞接種于6孔板，接種密度約為200個/孔，加入培養(yǎng)液1.5 ml/孔，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d換一次液，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。7 d后吸棄培養(yǎng)液，每個孔內(nèi)放入多聚甲醛(4 %)1 ml固定30 min后，吸棄固定液，每個孔內(nèi)加入潔凈的吉姆薩染料0.5 ml染色細(xì)胞大約25 min。小心棄去孔中的染料，將6孔板豎直緩慢在自來水中反復(fù)漂洗數(shù)次，靜置晾干，置于顯微鏡下拍照并進行圖像分析。

1.2.6

Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞侵襲情況 配置基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基比例為1 ∶3的配置液，取50 μl配置溶液加至Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)，慢慢風(fēng)干直至呈凝膠狀態(tài)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸浮液，顯微鏡下觀察并計數(shù)，取約1×10個細(xì)胞，200 μl無血清培養(yǎng)基加入Transwell小室上室，下室中加入500 μl 含胎牛血清培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后，取出小室，并用PBS輕輕漂洗2次，再進行30 min的甲醇固定，適當(dāng)風(fēng)干后，無菌棉簽輕輕擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，保留下室的細(xì)胞，結(jié)晶染液染色 15 min，在顯微鏡下計數(shù)。

1.2.7

流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 3組U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次后加入 binding buffer(500 μl)，加入5 μl Annxine-FITC 和5 μl Propidiumlodide，輕輕吹打混勻，避光室溫孵育30 min，上機(BD流式細(xì)胞儀)檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測正常腦組織細(xì)胞(N)和U251細(xì)胞LncRNA MEG3基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，在mRNA水平上膠質(zhì)瘤 U251細(xì)胞系中LncRNA MEG3的表達(dá)量低于正常腦組織細(xì)胞(N)，提示LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中低表達(dá)。

2.2 qRT-PCR檢測U251細(xì)胞LncRNA MEG3基因表達(dá)變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR檢測LncRNA MEG3轉(zhuǎn)染效果顯示， pCI-MEG3組LncRNA MEG3的表達(dá)水平高于Control組(

t

=9.96，

P

<0.01)和pCI組(

t

=9.22，

P

<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞LncRNA MEG3的表達(dá)情況與Control組和pCI組比較：**P<0.01

2.3 Western blot檢測U251細(xì)胞 LncRNA MEG3相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Western blot 結(jié)果顯示，3組內(nèi)參GADPH蛋白的表達(dá)相近， pCI-MEG3組MDM2蛋白表達(dá)低于Control組(

t

=2.18，

P

<0. 05)和pCI組(

t

=2.29，

P

<0. 05)，p53蛋白表達(dá)高于Control組(

t

=2.65，

P

<0. 05)和pCI組(

t

=2.50，

P

<0. 05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞MDM2和p53蛋白的表達(dá)情況與Control組和pCI組比較：*P<0.05

2.4 MTT法檢測LncRNA MEG3基因?qū)251細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與Control組和pCI組比較，pCI-MEG3組在轉(zhuǎn)染12 h后細(xì)胞生長無顯著差異。轉(zhuǎn)染24 h后，與Control組和 pCI組比較，pCI-MEG3組細(xì)胞生長受抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (

F

=10.72，

P

<0. 05)；轉(zhuǎn)染48 h后，與Control組和 pCI組比較，pCI-MEG3組細(xì)胞生長明顯受抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (

F

=17.94，

P

<0. 01)。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞在不同時間點增殖生長的情況與Control組和pCI組在同一時間點比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 細(xì)胞克隆實驗檢測LncRNA MEG3基因?qū)251細(xì)胞增殖的影響

將細(xì)胞克隆后的6孔板在顯微鏡下觀察。1周后在顯微鏡下觀察3組細(xì)胞克隆增殖情況，與Control組和 pCI組比較，pCI-MEG3組細(xì)胞增殖低于Control組(

t

=12.08，

P

<0. 01)和 pCI組(

t

=10.95，

P

<0. 01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞克隆增殖的影響情況 ×100與Control組和pCI組比較：**P<0.01

2.6 Transwell實驗檢測LncRNA MEG3基因?qū)251細(xì)胞侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng) 48 h 后，在顯微鏡下計數(shù)3組細(xì)胞中下室細(xì)胞的數(shù)量。pCI-MEG3組細(xì)胞數(shù)低于Control組(

t

=9.44，

P

<0. 01)和pCI組(

t

=9.63，

P

<0. 01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲能力的影響情況 ×400與Control組和pCI組比較：**P<0.01

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測LncRNA MEG3基因?qū)251細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，pCI-MEG3組細(xì)胞凋亡率高于Control組(

t

=13.17，

P

<0.01)和pCI組(

t

=13.88，

P

<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響情況與Control組和pCI組比較：**P<0.01

3 討論

LncRNA MEG3位于人類染色體14q32.3位點，是一個全長約為1 700個核苷酸的母源性印記基因，它也是第一個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的 LncRNA。LncRNA MEG3在許多正常組織中高表達(dá)，而在包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)。近幾年有研究表明LncRNA MEG3在不同分期和組織學(xué)分級腫瘤中的表達(dá)存在差異，在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物行為中扮演重要角色，在臨床上和患者預(yù)后密切相關(guān)。因此，目前LncRNA MEG3常被臨床研究上選擇作為抗腫瘤藥物的重要分子靶點，是控制基因治療可行性的關(guān)鍵因素之一。而啟動子或基因間差異甲基化區(qū)域的超甲基化可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中LncRNA MEG3低表達(dá)或表達(dá)丟失的主要原因。同時，有學(xué)者在文獻中提出腫瘤細(xì)胞中的LncRNA MEG3高表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，且LncRNA MEG3抑制細(xì)胞增殖能力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡部分原因可能是通過抑制MDM2的表達(dá)，隨后激活p53信號途徑。

該研究借助LncRNA MEG3過表達(dá)重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外實驗，來增加細(xì)胞內(nèi)LncRNA MEG3基因表達(dá)量，隨后探討其對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響。研究結(jié)果顯示，在mRNA水平上膠質(zhì)細(xì)胞中LncRNA MEG3的表達(dá)量明顯低于正常腦組織細(xì)胞，提示LncRNA MEG3可能是腦膠質(zhì)瘤的一個潛在獨立的診斷標(biāo)志。同時，研究結(jié)果表明LncRNA MEG3基因的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)聯(lián)緊密，過表達(dá)細(xì)胞中LncRNA MEG3基因后，可以抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，同時增加其凋亡率，這為腦膠質(zhì)瘤臨床基因治療提供了新的思路和理論依據(jù)。

然而對于LncRNA MEG3基因仍存在許多問題需要進一步探討和研究，如膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LncRNA MEG3基因的確切調(diào)控機制和調(diào)控路徑、LncRNA MEG3基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的其他基因之間的相互作用及與LncRNA MEG3基因相關(guān)的體內(nèi)實驗結(jié)論等。進一步深入研究這些問題，能夠為在基因水平上尋找新的分子靶向治療方案奠定理論基礎(chǔ)。