劉艷+周琳瑛+林曦

【摘要】 目的：探討孕期大鼠超聲輻照后對子代生長發(fā)育及大腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響，從而進(jìn)一步了解孕期超聲檢查的安全性。方法：以診斷劑量的超聲輻照對孕8 d SD大鼠分別在孕8 d（早期）、孕12 d（中期）及孕16 d（晚期）進(jìn)行3次時(shí)長分別為0 min（無超聲輻照，正常對照組）、5、10及20 min的超聲輻照后觀察子代大鼠生長發(fā)育及其大腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：超聲輻照20 min組子代大鼠P1、P3、P5、P7體重明顯低于對照組（0 min組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），首次睜眼時(shí)間亦明顯推遲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），前臂懸掛時(shí)間也短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。超聲輻照5 min組和10 min組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：孕期大鼠在孕早中晚期分別進(jìn)行一次超聲輻照，每次超聲輻照時(shí)長20 min，可影響子代大鼠生長發(fā)育并引起其大腦組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病變。

【關(guān)鍵詞】 超聲輻照； 子代大鼠； 生長發(fā)育； 腦組織； 電鏡技術(shù)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.35.030 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）35-0061-03

隨著診斷超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，其在產(chǎn)科應(yīng)用越來越廣泛，目前已成為發(fā)現(xiàn)胚胎異常及胎兒畸形首選的檢查手段。近年來，為了提高診斷準(zhǔn)確率，超聲儀器在裝備技術(shù)和軟件開發(fā)上日新月異，診斷超聲的頻率、輸出功率均有大幅提高，檢查時(shí)間也相應(yīng)增加，其潛在危險(xiǎn)就隨之增加。因胎兒組織細(xì)胞較成人更易受超聲生物效應(yīng)作用，診斷超聲的生物效應(yīng)對胎兒各系統(tǒng)的安全性問題越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1-2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察孕鼠早中晚期分別接受不同時(shí)長的超聲輻照后對子代大鼠生長發(fā)育和其大腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響，為臨床醫(yī)師在產(chǎn)科超聲檢查中更好地選擇輻照時(shí)間提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選健康的孕8 d的SD孕鼠（350±21.3）g 16只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀，采用腹部探頭頻率為3～5 MHz。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組 孕8 d的SD孕鼠（350±21.3）g 16只隨機(jī)分為四組，每組4只：對照組即無診斷超聲輻照組（0 min組）；超聲5 min 3次組，即應(yīng)用診斷超聲劑量對孕鼠腹部照射5 min，每隔4 d一次，連續(xù)3次（5 min組）；超聲10 min 3次組，即應(yīng)用診斷超聲劑量對孕鼠腹部照射10 min，每隔4 d一次，連續(xù)3次（10 min組）；超聲20 min 3次組，即應(yīng)用診斷超聲劑量對孕鼠腹部照射20 min，每隔4 d一次，連續(xù)3次（20 min組）。

而后，各組大鼠正常生產(chǎn)的子代依據(jù)生殖器與肛門之間的距離判斷雌雄，近者為雌，遠(yuǎn)者為雄。隨機(jī)取4只（雌雄各半），取腦組織進(jìn)行電鏡觀察以對比各組孕鼠子代腦組織的超微病理變化。

剩余的各組孕鼠生產(chǎn)的子代大鼠隨機(jī)抽取20只（雌雄各半）進(jìn)行生長發(fā)育的觀察，內(nèi)容包括出生7 d內(nèi)的體重變化、首次睜眼時(shí)間、雙上臂懸掛持續(xù)的時(shí)間。

1.3.2 體重測量 分別于出生即刻P1，出生后第3天P3，出生后第5天P5，出生后第7天P7時(shí)間段稱量子代大鼠體重，以克（g）為單位。

1.3.3 子代大鼠雙眼睜開時(shí)間記錄 記錄子代大鼠雙側(cè)眼睛初次睜開的日齡，以天（d）為單位。

1.3.4 子代大鼠上臂懸掛實(shí)驗(yàn) 出生后2周P14子代大鼠雙前腳抓住一水平金屬棍（直徑大約0.5 cm），距離桌面30 cm高度，記錄子代大鼠雙前腳抓牢金屬棍后身體懸掛持續(xù)的時(shí)間，并以分鐘（min）為單位計(jì)數(shù)。

1.3.5 子代大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠乙醚吸入麻醉后固定，開顱取大鼠腦皮質(zhì)約（0.1×0.1×0.1）cm3大小的組織4小塊，經(jīng)3%戊二醛-1.5%多聚甲醛（PH=7.4）前固定，4 ℃過夜，磷酸緩沖液（pH=7.4）漂洗3次后1%鋨酸-亞鐵氰化鉀溶液后固定2 h（4 ℃），標(biāo)本經(jīng)50%、70%、90%、100%乙醇，100%丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂Epon618浸透包埋，超薄切片經(jīng)硝酸鉛-醋酸鈾雙染后FEI Tecnai BioIWIN透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以（x±s）表示，采用one-way ANOVA（完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠接受不同時(shí)長超聲輻照對子代大鼠生長發(fā)育的影響

2.1.1 不同時(shí)長超聲輻照對子代大鼠出生后1周內(nèi)體重的影響 0 min組、5 min組、10 min組、20 min組子代大鼠不同日齡體重的變化見圖1。超聲輻照5 min組和0 min組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），超聲輻照10 min組子代大鼠雖然P1、P3、P5、P7體重均低于0 min組，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而超聲輻照20 min組P1、P3、P5、P7各日齡體重明顯低于0 min組，各日齡段，兩組的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.1.2 不同時(shí)長超聲輻照后子代大鼠首次睜眼時(shí)間比較 各組子代大鼠首次睜眼時(shí)間比較見表2。超聲輻照5 min組、10 min組子代大鼠睜眼時(shí)間與0 min組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而超聲輻照20 min組與0 min組比較，首次睜眼時(shí)間明顯推遲，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

各組子代大鼠上臂懸掛時(shí)間比較見表1。5 min組和10 min組子代大鼠上臂懸掛時(shí)間與0 min組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而20 min組與0 min組比較，上臂懸掛時(shí)間短，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。endprint

2.2 不同時(shí)長超聲輻照對子代大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響

對0 min組、5 min組、10 min組子代大鼠的腦組織進(jìn)行電鏡觀察，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器未見異常，神經(jīng)細(xì)胞突起無水腫等變化（圖2）。20 min組子代大鼠腦組織電鏡觀察可見部分神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，線粒體嵴稀疏斷裂（圖3），部分神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，核周隙亦腫脹（圖3）。

3 討論

超聲生物效應(yīng)是指一定強(qiáng)度的超聲波（由輻照聲強(qiáng)和輻照時(shí)間兩個(gè)因素決定）在生物體系內(nèi)傳播時(shí)，通過它們之間一定的相互作用機(jī)制（熱生物效應(yīng)、機(jī)械生物效應(yīng)）致使生物體系的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[3]。

近年來，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明高功率或者長時(shí)間超聲輻照會引起絨毛細(xì)胞腫脹甚至凋亡，子代體重減輕，胎兒角膜上皮腫脹，子代的生殖細(xì)胞線粒體腫脹等變化[4]。Ang等[5]研究發(fā)現(xiàn)孕期超聲輻照30 min或以上的子鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞有一部分未能移行到大腦皮質(zhì)相應(yīng)位置，這種異常分布的皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與超聲輻照時(shí)間成正相關(guān)；王勇等[6]研究發(fā)現(xiàn)孕期超聲20 min重復(fù)輻照可能對子鼠出生后的行為發(fā)育產(chǎn)生影響；栗建輝等[7]的研究則發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)三維超聲輻照孕晚期大鼠發(fā)現(xiàn)10 min后即可見部分細(xì)胞凋亡。

二維彩色多普勒超聲的輸出功率雖然比實(shí)時(shí)三維超聲低，但孕期常需多次超聲檢查，因而輻照的次數(shù)也比較多。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床孕婦的超聲檢查，在大鼠孕早期、中期、晚期分別予以診斷劑量超聲輻照，觀察不同輻照時(shí)長對子代大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)超聲輻照5 min及10 min組，子代大鼠出生時(shí)體重、首次睜眼時(shí)間及前臂懸掛能力與正常對照組相（0 min組）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），腦組織電鏡檢查也未發(fā)現(xiàn)異常，這與目前文獻(xiàn)[8-9]的研究結(jié)果一致。超聲輻照20 min組子代大鼠出生1周內(nèi)體重均比對照組輕，睜眼時(shí)間推遲，出生后2周，前臂懸吊能力弱于正常組，兩組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腦組織電鏡檢查發(fā)現(xiàn)部分神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亦可見擴(kuò)張，核周隙腫脹。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[10]研究結(jié)果類似。引起這些異常的原因還不確切，可能與直接的超聲輻照所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)，也可能是超聲輻照后引起胎盤絨毛細(xì)胞損傷而引起胚胎營養(yǎng)供應(yīng)不良有關(guān)。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ATP的場所，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的重要細(xì)胞器[11]，二者的損傷容易導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能受到影響。有報(bào)道探頭頻率為7.5 MHz的經(jīng)陰道超聲持續(xù)照射孕囊10 min可致絨毛細(xì)胞損傷，但是這些損傷是可逆的，超聲輻照后24 h損傷最明顯，而7 d后，絨毛細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常[12]。所以本實(shí)驗(yàn)觀察到的這些損傷是否可逆，則有待于對子代大鼠進(jìn)行更進(jìn)一步的中長期觀察。

綜上所述，孕鼠早、中、晚孕期接受診斷劑量超聲輻照5 min及10 min對子代大鼠生長發(fā)育及大腦組織結(jié)構(gòu)無明顯影響，而20 min后子代大鼠生長發(fā)育及神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有受損。ALUM提出了ALARA原則，即產(chǎn)科檢查時(shí)，在保證能獲得必要的超聲診斷信息的前提下，用盡可能小的超聲輸出功率，在盡可能短的時(shí)間（建議<20 min）內(nèi)完成檢查[13]。

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（收稿日期：2017-08-03）endprint