劉 倩，韓陳陳，羅婷婷，張 雨，李 浩，馬 旸，魏 偉

根據(jù)血管的結(jié)構(gòu)、功能和運輸方向差異，分為動脈、靜脈和毛細(xì)血管。血管壁作為血液與組織的邊界，由內(nèi)膜、中膜和外膜構(gòu)成。內(nèi)皮細(xì)胞主要存在于內(nèi)膜層，在生理條件下釋放一氧化氮(NO)、前列環(huán)素2(PGI2)和內(nèi)皮素(ET)，有助于松弛血管張力并調(diào)節(jié)血管對血漿成分和血小板的滲透性。中膜層由平滑肌細(xì)胞組成，可支持內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)血小板黏附和聚集。外膜層由結(jié)締組織組成，是血管與組織之間的邊界。

目前已有人、鼠、兔、犬等大血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，但關(guān)于大鼠較小血管如股動脈原代內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法及功能研究鮮有報道。大鼠股動脈位于腹股溝恥骨聯(lián)合處，管徑窄小，分離其原代內(nèi)皮細(xì)胞有一定難度。所以，探索一種簡便可行的提取、分離、培養(yǎng)方法十分必要。該研究綜合股動脈生理特性與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長需求，制備出一種有效、簡便的內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法，并對其進行了鑒定和功能研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取7～8周齡SPF級雄性Wistar大鼠，并飼喂于安徽醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心。溫度：20～26 ℃；日溫差：≤4 ℃；相對濕度：40%～70%。實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(北京)2016-0006。該實驗在處理動物過程中遵循安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理章程。

1.2 試劑

DMEM /F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、胎牛血清及PBS均購自以色列Biological Industries公司；胰酶(含EDTA)、青霉素-鏈霉素抗菌溶液、DAPI 染色液及防熒光淬滅封片液均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；CD31抗體購自美國GeneTEX公司；熒光抗體購自美國Proteintech公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；PGE2購自美國Cayman公司；TritonX-100購自中國Biosharp公司；基質(zhì)膠(Matrigel膠)、Transwell小室均購自美國Corning公司；結(jié)晶紫購自北京索萊寶生物公司。

1.3 主要儀器

-80 ℃超低溫冰箱：美國SANYO 公司；Cyto FLEX 型流式細(xì)胞儀：美國 Beckman Coulter 公司；BD FACSAria 分選型流式細(xì)胞儀：美國BD公司；BX-50型倒置顯微鏡：日本 OLYMPUS 公司；BX-53正置顯微鏡：日本 OLYMPUS 公司；2306-2 型 CO培養(yǎng)箱：美國SHEL LAB 公司；Image Xpress Micro 4型高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀：美國 Molecular Devcies 公司；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡：德國Leica公司。

1.4 大鼠股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞的分離

取7～8周齡雄性Wistar大鼠，注射2%戊巴比妥鈉處以安樂死，無菌打開恥骨聯(lián)合處分離股動脈；加入PBS清洗并除去血管上黏連的脂肪和結(jié)締組織；剪碎血管，4 ℃、4 000 r/min離心5 min；加入1 ml膠原酶Ⅳ消化液，37 ℃、200 r/min消化1.5～2 h；200目篩網(wǎng)過濾組織塊，離心并加入完全培養(yǎng)基重懸接種于T 25細(xì)胞瓶，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 大鼠股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

用倒置顯微鏡對培養(yǎng)的原代股動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進行觀察，并拍照記錄。

1.6 大鼠股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)14～16 d，鏡下觀察到細(xì)胞覆蓋面積達(dá)到2/3以上即可傳代。加入含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞萎縮變圓即加入DMEM/F 12培養(yǎng)基終止消化；離心并加入適量培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液：1 ∶2或1 ∶3進行傳代培養(yǎng)。

1.7 大鼠股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞純度檢測

將消化所得細(xì)胞4 ℃、2 000 r/min離心10 min;重懸后與加入CD31抗體孵育30 min；離心并加入適量PBS重懸；流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞比例。

1.8 分選和培養(yǎng)股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞

加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，以DMEM/F 12終止消化，移至15 ml無菌離心管；4 ℃、1 500 r/min離心5 min，以適量PBS重懸細(xì)胞；CD31抗體孵育1 h；加適量PBS，離心并以PBS重懸；分選所得細(xì)胞置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.9 激光共聚焦檢測股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞中CD31的表達(dá)

以4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；加0.5% Triton通透15 min；0.5% BSA封閉30 min；洗滌后即加入抗體CD31；4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后加入熒光抗體；避光孵育2 h；加DAPI染核，結(jié)合5 min；用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。

1.10 股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞功能實驗

1.10.1

細(xì)胞增殖實驗

1.10.1.1

CCK-8檢測法 胰蛋白酶消化細(xì)胞，以DMEM/F12終止消化并制備懸液；加入96孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)6 h，加0.3 μmol/L PGE；37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中孵育48 h；PBS洗滌細(xì)胞；每孔加CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)；2～4 h后，以酶標(biāo)儀檢測其吸光度(450 nm處)。

1.10.1.2

高內(nèi)涵細(xì)胞成像法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖實驗 內(nèi)皮細(xì)胞以每孔5×10密度接入96孔板中，加入0.3 μmol/L PGE預(yù)處理48 h，終止培養(yǎng)前，用 PBS清洗細(xì)胞；多聚甲醛固定30 min，加DAPI溶液結(jié)合5 min；加適量PBS并用高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)拍照。

1.10.2

內(nèi)皮細(xì)胞Transwell遷移實驗 內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔板；加入0.3 μmol/L PGE刺激48 h；消化細(xì)胞并將Transwell小室放入24孔板中；在下室中加入DMEM/F12培養(yǎng)基，上室加細(xì)胞懸液；37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中遷移12 h；將小室放入含結(jié)晶紫的甲醇溶液，固定15 min；顯微鏡下觀察拍照，每組隨機選取5個視野，計算遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.10.3

內(nèi)皮細(xì)胞成管實驗 內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔板，加0.3 μmol/L PGE刺激培養(yǎng)48 h；胰蛋白酶消化并制備細(xì)胞懸液；取Matrigel膠加入預(yù)冷96孔板中，板內(nèi)接入細(xì)胞懸液，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；顯微鏡下觀察拍照，每組隨機選取5個視野，計算內(nèi)皮細(xì)胞成管數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及純度檢測

顯微鏡下可觀察到大量獨立、渾圓、透亮的原代內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(圖1A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度為38.34%(圖2)。分選細(xì)胞14～16 d，細(xì)胞匯集成單層。其呈三角形、卵型不規(guī)則形狀，以鋪路石最為常見，無接觸抑制(圖1B)。

圖1 細(xì)胞生長概況A：原代內(nèi)皮細(xì)胞；B：分選原代內(nèi)皮細(xì)胞

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞純度A：陰性對照組；B：CD31陽性組

2.2 激光共聚焦法鑒定股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞

分選后以激光共聚焦法檢測細(xì)胞CD31表達(dá)情況，結(jié)果提示所得細(xì)胞均為CD31陽性(圖3)，符合內(nèi)皮細(xì)胞特征，股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞分離成功。

圖3 激光共聚焦法檢測內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)

2.3 股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞功能實驗

2.3.1

PGE對股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞活力以及增殖的影響 分選后內(nèi)皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，加CCK-8以檢測450 nm處的吸光度(optical density,OD)值。統(tǒng)計結(jié)果如圖4A所示，PGE組較未刺激組，內(nèi)皮細(xì)胞活力顯著提高(

SD

=1.24±0.240 325，

t

=-3.751)。高內(nèi)涵細(xì)胞成像法檢測原代內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力，結(jié)果如圖4B、C所示。測量視野中最大和最小的細(xì)胞核直徑，設(shè)定軟件識別細(xì)胞的直徑范圍，挑選熒光最強和最弱的細(xì)胞，測量熒光強度值，減去背景熒光強度，設(shè)定熒光強度的檢測范圍，調(diào)整兩個參數(shù)圈出所有細(xì)胞，選擇模塊分析細(xì)胞總數(shù)，導(dǎo)出結(jié)果至Excel 表格，統(tǒng)計每孔細(xì)胞數(shù)量，分析細(xì)胞增殖能力。如圖4B統(tǒng)計圖可知，PGE刺激組較未刺激組，可顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖(

SD

=1 575±0.575 000，

t

=-3.197)。

圖4 PGE2對內(nèi)皮細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖的影響A：CCK-8法檢測原代內(nèi)皮細(xì)胞活力統(tǒng)計圖；B：高內(nèi)涵成像法檢測原代內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力統(tǒng)計圖；C：高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)照片×10;與Normal組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3.2

PGE對股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響 Transwell小室檢測內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察如圖5所示。與正常組相比，PGE刺激后內(nèi)皮細(xì)胞遷移量明顯增多。對細(xì)胞進行計數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計作圖分析可知PGE可以顯著增強內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力(

SD

=1.334±0.334 000，

t

=-11.621)。

圖5 PGE2對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響A:Normal組；B:PGE2組；與Normal組比較：**P<0.01

2.3.3

PGE對股動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響 以Matrigel膠法檢測內(nèi)皮細(xì)胞成管功能，6 h成管能力良好。鏡下視野如圖6所示。與正常組比較，PGE刺激后細(xì)胞成管數(shù)量顯著增加。計算各個視野中成管數(shù)量，經(jīng)統(tǒng)計分析可知PGE可促進內(nèi)皮細(xì)胞血管生成功能(

SD

=1.378±0.378 000，

t

=-10.124)。

圖6 PGE2對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響A:Normal組；B:PGE2組；與Normal組比較：**P<0.01

3 討論

目前原代動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞提取分離方法多為組織塊黏附法和酶消化法，內(nèi)膜外翻法也可用作原代內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，但大鼠股動脈管徑狹小，給外翻法操作帶來困難。而酶消化法只需去除血管外部多余組織，即可進入消化步驟，效率顯著提高。

CD31即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(PECAM-1)，屬于免疫球蛋白超基因家族，在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)。流式結(jié)果表明CD31陽性細(xì)胞比例為38.34%，流式分選出CD31陽性細(xì)胞，激光共聚焦進一步鑒定內(nèi)皮細(xì)胞均為CD31陽性。綜上所述，酶消化法成功獲得CD31陽性原代血管內(nèi)皮細(xì)胞。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層覆蓋于血管腔表面連續(xù)的、扁平的單層鱗狀細(xì)胞。其在生物體內(nèi)具有調(diào)節(jié)血管舒張、維持凝血和纖溶系統(tǒng)的平衡、抑制血小板聚集、抑制炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的重要作用。在正常生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可維持機體穩(wěn)定，其被活化后功能受損。

大鼠股動脈血管既是營養(yǎng)動物下肢最重要的血管之一，也是距離關(guān)節(jié)最近的動脈血管。本實驗以大鼠為實驗動物，探索出一種既簡便又高效的股動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分離方法，為研究相對較小血管來源的內(nèi)皮細(xì)胞功能提供體外細(xì)胞模型。為與相對較小血管相關(guān)的疾病，如動脈粥樣硬化、血管炎、腦小血管疾病、糖尿病腎病以及泌尿系統(tǒng)疾病等研究帶來了便利。