蘇 叢,伍 婷,徐方明,陳昊然,劉艷艷,,4,律 娜,蘭燕虎,4,李家斌,,,4

近些年，肺炎克雷伯菌(

klebsiella

pneumoniae

， Kp)的高致病性感染在世界范圍內(nèi)不斷被報道，人類健康也因此受到嚴重威脅。當微生物侵入機體時，巨噬細胞首先對病原體發(fā)揮吞噬作用，此為固有免疫；而晚期核內(nèi)體溶酶體適配器(late endosomal/lysosomal adaptor 2，Lamtor2)在吞噬的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用；Lamtor2也是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及哺乳動物雷帕霉素(mTOR)激活物/調(diào)節(jié)劑復(fù)合物2的靶點。巨噬細胞在抗感染免疫過程中，巨噬細胞的Lamtor2分子與細胞向M1分化及其對病原菌殺傷力密切相關(guān)。該實驗通過構(gòu)建、飼養(yǎng)、繁育和鑒定

Lamtor

2條件性基因敲除小鼠，獲得

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre鼠，建立

Lamtor

2巨噬細胞條件敲除小鼠感染Kp模型，為探究

Lamtor

2基因在抗Kp感染免疫過程中的機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實驗動物

Lamtor

2/+小鼠共 3 只，雌鼠 1 只、雄鼠 2 只；

Lyz

2-Cre工具鼠共2只，雌、雄各1只，均購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，20～30 g/6周齡，小鼠品系為C57BL/6J，無特殊病原體(SPF級)，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0032，使用許可證號：SYXK(皖)2017-006；倫理審批號：LLSC20190253。實驗過程遵循3R原則。

1.1.2

試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒(貨號：JL45852)購自北京天根生化科技有限公司；Taq PCR Master Mix(貨號：RR901)、TB Green Premix Ex Taq(貨號：RR420)以及DL2 000 bp DNA marker(批號：A1A0438)均購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖粉(批號：111860)購自上海生工生物工程股份有限公司。β-Actin抗體(貨號：sc-47778)購自美國Santa Cruz公司；iNOS抗體(貨號：AF0199)購自美國Affinity公司；二抗山羊抗IgG/辣根酶標記[貨號：ZB-2305(抗鼠)、ZB-2301(抗兔)]購自北京中杉金橋公司。

熒光定量PCR儀(羅氏LightCycler 96，瑞士)，基因擴增儀(Biometra Tone，德國)，Western blot電泳儀(Bio-Rad，美國)，凝膠電泳成像儀(Tanon 5 200 Multi，上海天能)。

1.2 實驗方法

1.2.1

小鼠的飼養(yǎng)與繁殖 根據(jù)國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，將小鼠飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學SPF級動物房中，室溫控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，保證12 h光照，晝夜交替。飼養(yǎng)過程中保持無菌環(huán)境，觀察并記錄小鼠生長發(fā)育情況。將性成熟(6～9周齡)的雌鼠與其中一只雄鼠同籠合養(yǎng)進行繁殖，每周給予滅菌的蛋黃和瓜子補充營養(yǎng)。小鼠的平均發(fā)情周期為4～5 d，發(fā)情時間約20 h，妊娠期19～21 d，子代出生后20～21 d斷奶分籠，雌性幼鼠和雄性幼鼠分籠飼養(yǎng)。

1.2.2

小鼠親代及子代信息記錄 為詳細記錄繁殖后代的信息，設(shè)計親代和子代標簽，在親代標簽中，針對小鼠的籠號、基因型、出生日期、周齡、合籠日期、產(chǎn)仔日期和數(shù)量進行詳細記錄；在子代標簽中，對幼鼠的籠號、出生日期、周齡、來源籠進行詳細記錄。

1.2.3

小鼠基因型鑒定 鼠出生后3～4周與母鼠分籠，剪取小鼠腳趾0.3～0.5 cm置無菌1.5 ml EP管中，并依據(jù)剪取的不同腳趾標記小鼠。用基因組DNA提取試劑盒提取小鼠基因組DNA，所得樣品置-20 ℃保存。采用PCR法：

flox

基因上游引物: 5′-CCAAATGAACCAAAGTCCAGTCTGC-3′；下游引物：5′-GGAACACAGTGAACAGGAACTAAGG-3′；Cre基因上游引物：5′-TGGAATGGCTGGCTACTATGG-3′；下游引物：5′-TGCAATTGATCCCACAGGCA-3′，5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′。反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)程序：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃、1 h。配制2.5%的瓊脂糖凝膠：稱取2.5 g瓊脂糖粉末溶于100 ml 1×TAE電泳緩沖液中，微波爐中高火加熱3 min，冷卻約7 min后加入10 μl EB核酸染料，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，制膠。取5 μl PCR產(chǎn)物和3 μl DL 2 000 bp DNA marker加入上樣孔中進行電泳分析，恒壓150 V，時間45 min；然后置于凝膠電泳成像儀中成像，觀察電泳條帶。若PCR條帶出現(xiàn)與flox基因、Cre基因PCR產(chǎn)物大小一致的條帶則為陽性結(jié)果，即

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre。

1.2.4

Lamtor

2基因敲除效果驗證 待小鼠成熟至8周齡，收集

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠和

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠肺泡巨噬細胞，采用qRT-PCR方法檢測兩組

Lamtor

2 mRNA的表達。

Lamtor

2基因上游引物：5′-ATAATGAGGGATCGCTGCTGG- 3′；下游引物：5′-CTACGGTCTCCTTGGCATACA- 3′；內(nèi)參GAPDH基因上游引物：5′-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3′；下游引物：5′-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3′。

1.2.5

小鼠肺泡巨噬細胞iNOS表達水平檢測 用RIPA裂解液提取

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre和

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠肺泡巨噬細胞蛋白，吸取30 μl上清液與上樣緩沖液混合后金屬浴煮沸10 min變性，將所制蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，恒壓75 V、120 min；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇浸泡數(shù)分鐘且適當大小的PVDF膜上，恒流220 mA，冰上轉(zhuǎn)膜1～2 h后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入經(jīng)Western blot一抗稀釋液稀釋的β-Actin抗體(1 ∶5 000)、Lamtor2抗體(1 ∶1 000)和iNOS抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜；1×TBST緩沖液洗膜3 次，每次10 min；加入5%脫脂奶粉稀釋的山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗(1 ∶10 000)孵育2 h，1×TBST緩沖液洗脫3 次后化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照。觀察Lamtor2和iNOS的表達情況，進一步確定

Lamtor

2敲除后的殺菌活性效果。

1.2.6

小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)炎癥因子表達水平檢測 收集繁殖子代中野生型小鼠的肺泡巨噬細胞作為對照組，而純合子小鼠的肺泡巨噬細胞作為實驗組，分別感染肺炎克雷伯標椎菌株(ATCC 43816)(細菌 ∶細胞=10 ∶1)，刺激6 h后收集細胞，采用RT-qPCR方法檢測兩組細胞分泌的炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(interleu kin,IL)-1β和Cxcl1的mRNA相對表達量。

1.2.7

小鼠Kp肺部感染 小鼠處于麻醉狀態(tài)下，鼻內(nèi)注射1×10CFU的Kp(ATCC 43816)50 μl，觀察小鼠的生存狀況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，每組實驗重復(fù)3 次，組間比較采用

t

檢驗。對于生存曲線比較，使用Log-rank (Mantel-Cox) test分析結(jié)果，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖及發(fā)育

Lamtor

2/+自交后雌鼠 1 個月內(nèi)生產(chǎn)幼鼠10 只，幼鼠出生后由母鼠母乳喂養(yǎng)，新生小鼠無毛發(fā)，全身粉紅色；哺乳期約3周，存活10只，其中，

Lamtor

2/1只，雄性。

Lamtor

2/+雄鼠與

Lyz

2-Cre雌鼠雜交后1月內(nèi)生產(chǎn)幼鼠共8只，其中

Lamtor

2/+

Lyz

2-Cre3只。

Lamtor

2/雄性小鼠與

Lamtor

2/+

Lyz

2-Cre雌性小鼠交配1個月內(nèi)生產(chǎn)幼鼠共 5只。

2.2 小鼠基因型鑒定結(jié)果

取幼鼠腳趾組織進行PCR擴增，

flox

基因型鑒定如圖1所示。

圖1 flox基因型鑒定結(jié)果M：Marker；1：Lamtor2flox/flox純合子小鼠；2、3、4、5：Lamtor2flox/+雜合子小鼠

圖2 Cre基因型鑒定結(jié)果M：Marker；1和4：Lyz2-Cre+/-；2、3、5：Lyz2-Cre-/-

2.3 條件基因敲除小鼠肺泡巨噬細胞

2 mRNA水平鑒定

分別提取10只實驗組和10只對照組小鼠肺泡巨噬細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR結(jié)果如圖3所示，

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠

Lamtor

2 mRNA的表達低于

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠[(0.06±0.006)

vs

(1.00±0.003)，

P

<0.01]。

圖3 兩組小鼠Lamtor2 mRNA表達量1：Lamtor2flox/floxLyz2-Cre-/-小鼠；2：Lamtor2flox/flox Lyz2-Cre+/-小鼠；與Lamtor2flox/floxLyz2-Cre+/-比較：**P<0.01

2.4 蛋白水平的

2基因敲除鑒定和肺泡巨噬細胞感染后iNOS表達

提取兩組小鼠肺泡巨噬細胞蛋白進行Western blot檢測，結(jié)果如圖4所示，與

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠比較，

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠Lamtor2蛋白不表達，且

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠肺泡巨噬細胞在感染Kp 6 h后，iNOS表達減少。

圖4 兩組小鼠肺泡巨噬細胞Lamtor2及感染后iNOS蛋白表達1：Lamtor2flox/floxLyz2-Cre-/-小鼠；2：Lamtor2flox/flox Lyz2-Cre+/-小鼠

2.5

2

2-Cre

小鼠感染Kp后生存狀況觀察

為了研究

Lamtor

2基因在Kp感染中發(fā)揮的作用，對照組和實驗組分別取10只小鼠，通過鼻滴法制作感染Kp小鼠肺炎模型，監(jiān)測小鼠7 d病死率。

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠組7 d病死率為30%，

Lamtor

/

Lyz

2-Cre小鼠7 d病死率為80%(中位生存時間=89.5 h，

P

=0.032 6)，差異有統(tǒng)計學意義(圖5)。

圖5 兩組小鼠感染后7 d存活率與Lamtor2flox/floxLyz2-Cre-/-比較：*P<0.05

2.6 Kp感染

2條件性基因敲除小鼠的肺泡巨噬細胞炎癥因子的分泌水平

選取

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠的肺泡巨噬細胞為對照組，而

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre小鼠的肺泡巨噬細胞為實驗組，分別感染Kp后，實驗組細胞內(nèi)的炎性因子TNF-α(

t

=17.54，

P

=0.003 2)、IL-1β(

t

=15.37，

P

=0.004 2) 和Cxcl1(

t

=37.82，

P

=0.000 7)的相對表達量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(圖6)。

圖6 兩組小鼠肺泡巨噬細胞感染后炎癥因子mRNA表達與Lamtor2flox/floxLyz2-Cre+/-比較：**P<0.01

3 討論

基因敲除技術(shù)是在20世紀80年代后半期根據(jù)DNA同源重組原理而發(fā)展起來的。它從分子水平上去除或替代一個基因，整體水平觀察實驗動物，以此檢測被敲除基因功能的實驗方法。有文獻指出，基因敲除可能對小鼠的生殖功能有影響，但該實驗表明條件性基因敲除

Lamtor

2基因后并沒有影響小鼠的生育能力。利用Cre-flox重組酶系統(tǒng)敲除小鼠中

Lamtor

2基因，通過繁育和基因鑒定，成功篩選出純合子幼鼠(

Lamtor

2/

Lyz

2-Cre)；繁殖子代中的純合子可用作實驗組，野生型用作對照組。當病原體侵入機體時，巨噬細胞的吞噬作用是固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；

Lamtor

2調(diào)節(jié)著內(nèi)體-溶酶體系統(tǒng)，激活巨噬細胞MAPK中的ERK信號通路，進一步激活NADPH吞噬氧化酶的組裝，使吞噬體獲得完整抗菌特性。它的缺失會影響NADPH吞噬氧化酶及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的活化，從而抑制ROS及NO的產(chǎn)生，降低細胞感染病原體時所發(fā)揮的抗菌活性。在吞噬過程中，病原體表面同源配體與細胞膜上受體的相互作用導(dǎo)致其內(nèi)化為噬菌體，需要與內(nèi)體組分融合形成成熟吞噬體，最終與溶酶體融合殺死微生物。事實上，

Lamtor

2基因在吞噬體與溶酶體的融合過程中充當重要角色。

Lamtor

2基因的缺失會導(dǎo)致晚期內(nèi)體(Rab7)在吞噬小泡上的分布和表達的急劇下降，使得吞噬體-內(nèi)泌體復(fù)合物向溶酶體的錯誤轉(zhuǎn)運，殺菌功能下降。該實驗結(jié)果顯示，條件基因敲除小鼠對Kp感染的抵抗能力減弱，病死率高。iNOS的表達隨著

Lamtor

2基因的敲除而降低，說明MAPK-ERK信號通路殺菌效應(yīng)受到了影響，而

Lamtor

2基因?qū)⒕?yīng)蛋白iNOS的調(diào)控作用，可能也是宿主抵抗Kp感染的機制之一。此外，感染Kp的

Lamtor

2條件敲除小鼠肺泡巨噬細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β和Cxcl1的mRNA相對表達量均降低，由此可見，

Lamtor

2促進了Kp感染巨噬細胞的殺菌過程。該研究成功構(gòu)建的

Lamtor

2條件基因敲除小鼠可以為后續(xù)研究

Lamtor

2基因在宿主抗感染的免疫機制奠定了基礎(chǔ)。