江 斕，鐘 興，潘天榮

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN) 是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，大部分患者會發(fā)展為晚期腎病。盡管目前臨床采用抗高血壓等方法治療DN患者，但其治療效果不佳。DN發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)為足細胞損傷。因此，預(yù)防或改善足細胞損傷對延緩DN的進展具有重要意義。

miRNAs是具有高度保守性的單鏈非編碼小RNA。近年來研究顯示miRNAs與DN關(guān)系密切。最新的研究報道，miR-483-5p與糖尿病有關(guān)。基于此，該研究采用棕櫚酸(palmitic acid, PA)模擬高脂環(huán)境處理小鼠腎足細胞，探討miR-483-5p在棕櫚酸誘導(dǎo)損傷的足細胞中的作用及潛在機制，為明確DN的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞株 小鼠腎足細胞購自ATCC。

1.1.2

主要試劑 PA(P0500，純度≥99%)、小鼠重組干擾素-γ(407320)、0.25%胰蛋白酶(T4049)均購自美國Sigma公司；RMPI 1640培養(yǎng)基(31800)、CCK-8試劑(YZ-CK04)、RIPA buffer(P0013)、丙二醛(MDA；BC0025)、超氧化物歧化酶(SOD；BC0170)和BCA蛋白分析(PC0020)試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；TRIzol(15596-026)、Lipofectamine3000(L3000015)、pcDNA3.1 vector(V79020)、pMIR-Report luciferase vector (AM5795)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-483-5pinhibitor (miR20004782-1-5)、miRNA inhibitor陰性對照(iR2N0000001-1-5)、miR-483-5p mimic(miR10004782-1-5)、miRNA mimic陰性對照(miR1N0000001-1-5)均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告測定系統(tǒng)(Promega，E1910) 購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT Master Mix(RR036A)、SYBR Premix Ex Taq II Kit(RR820A)均購自北京TaKaRa生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE；P0012A)、PVDF膜(FFP28)、ECL kit(P0018FS)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔Cleaved Caspase-3 抗體(1/500，ab2302)、兔Nephrin抗體(1/1 000，ab216341)、鼠GAPDH抗體(1/500，ab8245)、山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1/5 000，ab205718，)、山羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1/5 000，ab205719)均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；兔Podocin抗體(Santa，sc-22294)購自美國圣克魯斯生物技術(shù)有限公司(Dallas, Texas)。

1.1.3

儀器 MultiskanFC 酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；C1000 ThermalCycler轉(zhuǎn)錄儀購自美國BIO RAD公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Lumat LB 9507 luminometer購自德國Berthold Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養(yǎng) 小鼠腎足細胞加入含10%胎牛血清和10 U/ml小鼠重組干擾素-γ的RMPI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2

細胞分組 ① 為確定棕櫚酸對小鼠腎足細胞的最佳損傷濃度，使用梯度濃度棕櫚酸(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L)處理小鼠腎足細胞24 h。② 為探究miR-483-5p在小鼠腎足細胞損傷中的作用，將小鼠腎足細胞分為4組：control、PA、PA+NC、PA+miR-483-5p inhibitor。③ 為進一步探究miR-483-5p mimic和KLF2在小鼠腎足細胞損傷中的作用，將小鼠腎足細胞分為4組：control、PA+NC、PA+miR-483-5p mimic、PA+miR-483-5p mimic+KLF2。

1.2.3

細胞轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine3000試劑將miR-483-5p inhibitor、miRNA inhibitor control、miR-483-5p mimic、miRNA mimic control、KLF2過表達質(zhì)粒和空載pcDNA3.1 vector按上述細胞分組轉(zhuǎn)染到細胞中，轉(zhuǎn)染48 h，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4

熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建及報告基因檢測 Starbase預(yù)測miR-483-5p靶基因。含有miR-483-5p預(yù)測靶點的KLF2 3′‐UTR mRNA和定點誘變的KLF23′‐UTR mRNA由RiboBio公司擴增并克隆到Report luciferase vector。分別對應(yīng)KLF2-WT和KLF2-MUT。小鼠腎足細胞(1.5×10)接種于12孔板培養(yǎng)1 d，然后利用Lipofectamine 3000將轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-483-5p mimic, miRNA mimic陰性對照和1 ng pMIR-KLF2-WT或KLF2-MUT，50 ng pRL-Tk-Renilla熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進細胞。轉(zhuǎn)染48 h，在Lumat LB 9507 luminometer上用雙熒光素酶報告測定系統(tǒng)測定熒光活性。

1.2.5

CCK-8 轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的小鼠腎足細胞以2.5×10個/ml濃度接種于96孔板。RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，使用棕櫚酸處理小鼠腎足細胞24 h。隨后加入10 μl CCK-8試劑孵育1 h，酶標儀測定450 nm處吸光度值并計算細胞活力。

1.2.6

實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol 試劑分離細胞中的總RNA。以1 μg總RNA為原料，用PrimeScriptRT Master Mix及反轉(zhuǎn)錄儀合成cDNA。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)利用SYBR Premix Ex Taq II Kit進行。擴增條件設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)?；蛩降谋磉_用2表示。引物序列：KLF2-F,5′-ACCAAGAGCTCGCACCTAAA-3′和KLF2-R,5′-GTGGCACTGAAAGGGTCTGT-3′；GAPDH-F,5′-AGG TCGGTGTGAACGGATTTG-3′和GAPDH-R,5′-GGG GTCGTTGATGGCAACA-3′；miR-483-5p-F,5′-AAG ACGGGAGGAAAGAAGGGAG-3′和miR-483-5p-R,5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6-F,5′-CTCG CTTCGGCAGCACA-3′和U6-R,5′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。U6和GAPDH分別作為miRNA和KLF2的內(nèi)參。

1.2.7

檢測細胞凋亡 收集細胞，用1 ml 1×Binding Buffer重懸細胞(1×10個/ml)。向每100 μl的細胞懸液(1×10個)中加入5 μl Annexin V-FITC和 PI，室溫避光孵育10 min后，盡快通過流式細胞術(shù)分析染色的細胞。

1.2.8

檢測氧化應(yīng)激指標 細胞離心破碎取上清液，置冰上待測。利用分光光度計按照試劑盒操作計算得到細胞中MDA和SOD的含量。

1.2.9

Western blot 每1 ml冷裂解緩沖液中加入10 μl磷酸酶抑制劑，1 μl 100 mmol/L蛋白酶抑制劑。將細胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 ml EP管中，并將制備好的裂解緩沖液加入細胞中，4 ℃裂解15 min。離心后，得上清液。利用BCA試劑盒測定蛋白含量。用12% SDS-PAGE分離蛋白，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜與一抗孵育，4 ℃過夜。加入二抗，室溫孵育1 h。使用ECL試劑進行化學(xué)發(fā)光檢測。用ImageJ軟件分析條帶凈吸光度值，GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

該研究中的數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0分析統(tǒng)計。兩組間差異通過Student雙尾

t

檢驗比較；兩組以上數(shù)據(jù)間的差異通過單因素方差分析(one-way ANOVA)比較，然后通過Bofferroni檢驗進行兩兩比較。

P

<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)棕櫚酸對細胞活力的抑制作用

棕櫚酸濃度依賴性地抑制細胞活力(圖1A，

P

<0.05，

F

=47.12)并促進細胞miR-483-5p的表達(圖1B，

P

<0.05，

F

=112.6)。當棕櫚酸濃度為0.5 mmol/L時，細胞活力(45±5)%減少大于50%，見圖1A。因此選擇0.5 mmol/L作為后續(xù)實驗處理條件。0.5 mmol/L棕櫚酸能夠促進miR-483-5p表達(圖1C，

P

<0.05，

F

=56.56)，而miR-483-5p inhibitor在一定程度上逆轉(zhuǎn)此作用(圖1C，

P

<0.05)。細胞經(jīng)0.5 mmol/L棕櫚酸處理24 h后，細胞活力降低(圖1D，

P

<0.05，

F

=42.88)，而miR-483-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)此作用(圖1D，

P

<0.05)。

圖1 miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)棕櫚酸對細胞活力的抑制作用A：CCK-8檢測不同濃度棕櫚酸對小鼠腎足細胞活力的影響；B、C：實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-483-5p表達水平；D：CCK-8檢測細胞活力，U6起內(nèi)參作用；PA：棕櫚酸；NC：miRNA inhibitor陰性對照；I：miR-483-5p inhibitor；與Control組比較：*P<0.05，***P<0.001；與PA+NC組比較：##P<0.01

2.2 miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)棕櫚酸對細胞凋亡和氧化應(yīng)激的促進作用

棕櫚酸促進細胞凋亡，而miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)此作用(圖2A、B，

P

<0.05,

F

=86.26)。棕櫚酸促進細胞MDA表達水平(圖2C，

P

<0.05，

F

=85.64)，抑制SOD表達水平(圖2D，

P

<0.05,

F

=104.1)，而miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)此作用(圖2C、D，

P

<0.05)。

圖2 miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)棕櫚酸對細胞凋亡和氧化應(yīng)激的促進作用A、B：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡；C、D：比色法檢測各組MDA和SOD表達水平；PA：棕櫚酸；NC：miRNA inhibitor陰性對照；I：miR-483-5p inhibitor；與Control組比較：***P<0.001；與PA+NC組比較：###P<0.001

2.3 miR-483-5p直接靶向KLF2

Starbase結(jié)果表明，miR-483-5p在KLF2基因的3′-UTR上具有結(jié)合位點，見圖3A。雙熒光實驗結(jié)果顯示，與Blank+KLF2-WT組比較，miR-483-5p mimic+KLF2-WT組熒光活性降低(圖3B，

P

<0.05，

t

=12.44)，miR-483-5p mimic+KLF2-MUT組熒光活性改變(圖3B，

P

>0.05，

t

=0.6367)。棕櫚酸組較Control組的KLF2表達降低(圖3C，

P

<0.05，

F

=20.94)，miR-483-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)棕櫚酸的作用(圖3C，

P

<0.05)。

圖3 miR-483-5p直接靶向KLF2A：Starbase 預(yù)測miR-483-5p在KLF2基因3′‐UTR上的結(jié)合位點；B：足細胞轉(zhuǎn)染KLF2-WT或KLF2-MUT和M，雙熒光報告實驗檢測足細胞的熒光素酶活性；C：PA處理I 或 NC轉(zhuǎn)染的足細胞，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測足細胞中KLF2的表達水平，GAPDH起內(nèi)參作用；PA：棕櫚酸；M：miR-483-5p mimic；NC：miRNA inhibitor陰性對照；I：miR-483-5pinhibitor；KLF2-WT：野生型KLF2；KLF2-MUT：突變型KLF2；與Blank組比較：###P<0.001；與Control組比較：***P<0.001；與PA+NC組比較：△△P<0.01

2.4 KLF2部分逆轉(zhuǎn)miR-483-5p mimic的作用

0.5 mmol/L棕櫚酸處理小鼠腎足細胞后，KLF2表達水平降低(圖4A,

P

<0.05,

F

=92.27)，細胞活力降低(圖4B,

P

<0.05,

F

=81.67)，MDA水平升高(圖4C,

P

<0.05，

F

=89.49)，SOD水平降低(圖4D,

P

<0.05,

F

=130.8)，C caspase3的表達升高(圖4E、F,

P

<0.05,

F

=54.16)，Nephrin(圖4E、F,

P

<0.05,

F

=80.82)和Podocin(圖4E、F,

P

<0.05,

F

=100.6)的表達降低，miR-483-5p mimic增強棕櫚酸作用(圖4A～F,

P

<0.05)，而miR-483-5p mimic作用被KLF2過表達部分逆轉(zhuǎn)(圖4A～F,

P

<0.05)。

圖4 KLF2部分逆轉(zhuǎn)miR-483-5p mimic的作用A：qRT-PCR檢測KLF2在各組中的表達水平；B：CCK-8檢測各組細胞活力；C：比色法檢測各組中MDA的表達水平；D：比色法檢測各組中SOD的表達水平；E、F：Western blot檢測各組中C caspase3、Nephrin以及Podocin表達水平，GAPDH起內(nèi)參作用；PA：棕櫚酸；NC：miRNA inhibitor陰性對照；M：miR-483-5p mimic；1：Control；2：PA+NC；3：PA+M；4：PA+M+KLF2; 與Control組比較：***P<0.001；與PA+NC組比較：△△△P<0.001；與PA+M組比較：###P<0.001

3 討論

腎小球足細胞是一種高度分化的終末上皮細胞，缺乏增殖能力，在DN的發(fā)病過程中，足細胞的損傷扮演著舉足輕重的角色。在該研究中，梯度濃度的棕櫚酸作用于小鼠腎足細胞后，小鼠腎足細胞活力被抑制，且呈一定的濃度依賴性，這與相關(guān)的研究具有一致性,說明棕櫚酸處理可導(dǎo)致小鼠腎足細胞增殖能力相對減弱，誘導(dǎo)細胞損傷。

血清miR-483-5p的上調(diào)可能與急性排斥反應(yīng)所引起的腎損傷有關(guān)。在該研究中，棕櫚酸能夠呈濃度依賴性地促進miR-483-5p表達，說明miR-483-5p可能參與了棕櫚酸損傷足細胞的過程。進一步表明，抑制miR-483-5p表達后，細胞活性得到恢復(fù)，而細胞凋亡受到抑制，說明抑制miR-483-5p可以部分逆轉(zhuǎn)棕櫚酸所抑制的細胞增殖以及棕櫚酸促進的細胞凋亡。研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)對腎組織造成的損傷是糖尿病腎病的重要發(fā)病機制之一，同時也是造成足細胞損傷的重要原因：MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的常用指標，而SOD是重要的抗氧化酶。在本研究中，棕櫚酸能夠升高MDA表達水平，降低SOD水平，而miR-483-5p抑制后，MDA表達降低，SOD表達升高。由此可見，抑制miR-483-5p表達可以通過促進細胞活力，抑制凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效地保護棕櫚酸誘導(dǎo)的足細胞損傷。

在糖尿病小鼠中，KLF2對預(yù)防腎小球內(nèi)皮細胞和足細胞損傷具有至關(guān)重要的作用，且KLF2是小鼠和人類蛋白尿的重要調(diào)節(jié)因子。一些研究報道了miRNA可以通過靶向KLF2表達，進而調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種生理和病理機制。結(jié)果顯示，在棕櫚酸損傷的足細胞中，miR-483-5p直接靶向KLF2，并負反饋調(diào)節(jié)KLF2的表達。后續(xù)研究表明，在棕櫚酸處理的足細胞中，miR-483-5p mimic能夠進一步促進棕櫚酸對細胞活力的抑制作用并促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，然而，KLF2過表達部分逆轉(zhuǎn)miR-483-5p mimic的作用。

裂解的caspase3(C caspase3)被認為是凋亡途徑的執(zhí)行者，C caspase3的激活是誘導(dǎo)凋亡所必需的步驟。Nephrin和Podocin是足細胞損傷的重要標志，均對足細胞裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能維持發(fā)揮重要作用，并且Nephrin和Podocin表達下降與蛋白尿的發(fā)生及腎小球疾病進展密切相關(guān)。有研究表明，棕櫚酸可劑量依賴性地減弱足細胞Nephrin、Podocin 表達水平。該研究表明，在棕櫚酸損傷的足細胞中，miR-483-5p mimic能夠促進C caspase3表達并抑制Nephrin和Podocin表達，KLF2過表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-483-5p mimic對C caspase3、Nephrin和Podocin表達的作用。結(jié)果顯示，miR-483-5p過表達可以通過抑制KLF2的表達，進而抑制足細胞活力、促進凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進一步增強棕櫚酸對足細胞的損傷作用。