徐大來，司 遠(yuǎn)，田 蕾，肖 斌，何遠(yuǎn)清，朱 毅*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胰腺中心，2普外科，江蘇 南京 210029；3天津天銳生物科技有限公司，天津 300000；4江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

免疫治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的主要手段［1-2］。免疫治療的手段之一，基于T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的過繼性細(xì)胞免疫治療在血液腫瘤、黑色素瘤等已取得顯著進(jìn)展［3-4］，在實(shí)體瘤方面，嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy）的臨床應(yīng)用研究也正在積極開展。過繼性細(xì)胞免疫治療的發(fā)展離不開T、NK 等免疫細(xì)胞放大培養(yǎng)和殺傷功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與基礎(chǔ)研究的發(fā)展。開展過繼性細(xì)胞免疫治療的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用研究和轉(zhuǎn)化研究的首要前提是建立穩(wěn)定、相對(duì)精準(zhǔn)、適合免疫細(xì)胞特點(diǎn)的檢測(cè)方法與技術(shù)平臺(tái)。

免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性功能的精準(zhǔn)檢測(cè)是實(shí)際工作的關(guān)鍵。一方面，經(jīng)驗(yàn)顯示1 cm3大小的瘤塊中約有1×1010個(gè)瘤細(xì)胞，需要至少10倍于瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞才能保證有效的抑制和殺傷效果［5］，因此在免疫效應(yīng)細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定擴(kuò)增培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái)上，增殖實(shí)驗(yàn)不可或缺。另一方面，對(duì)于體外分離、擴(kuò)增或改造的免疫效應(yīng)細(xì)胞的體內(nèi)應(yīng)用，需要通過大量的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確鑒定效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤靶細(xì)胞的功能。現(xiàn)有的體外增殖和細(xì)胞毒相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法種類繁多，準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)性、可操作性不一，而且部分實(shí)驗(yàn)受限于實(shí)驗(yàn)室條件無法開展。選對(duì)適合的增殖或細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法，不僅可以少走彎路、事半功倍、節(jié)省有限的經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)資源，而且有助于建立穩(wěn)定精準(zhǔn)的技術(shù)平臺(tái)和進(jìn)一步推進(jìn)過繼性免疫治療相關(guān)的研究。因此，鑒定免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞毒活性技術(shù)方法的對(duì)比研究與系統(tǒng)總結(jié)有重要的實(shí)用價(jià)值。

NK92 細(xì)胞系由Klingemann 博士的實(shí)驗(yàn)室分離和鑒定，來自患有NK 細(xì)胞淋巴瘤的患者［6］。相對(duì)于從志愿者體內(nèi)原代分離的免疫效應(yīng)細(xì)胞，NK92細(xì)胞系具有免疫效應(yīng)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)特性、增殖特性和殺傷能力，是可替代原代效應(yīng)細(xì)胞的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。因此，本研究以NK92為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞，對(duì)比研究與系統(tǒng)總結(jié)目前常用的體外增殖和細(xì)胞毒相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法，旨在總結(jié)各類方法的特點(diǎn)與適用性的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

NK92 細(xì)胞系、帶有熒光素酶的K562 細(xì)胞系由合作單位天津天銳生物科技有限公司贈(zèng)送；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2（長(zhǎng)春生物制品研究所）；IL-15（Proteintech 公司，美國(guó)）；CCK-8 試劑盒、鈣黃綠素Calcein-AM（同仁化學(xué)公司，日本）；EdU 試劑盒（蘇州US EVERBRIGHT 公司）；CFSE（Sigma 公司，美國(guó)）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司）；CellTracker Deep Red（Invitrogen 公司，美國(guó)）；ATP（北京阿拉丁公司）；Triton X-100（北京索萊寶公司）；熒光素鈉（BioVision公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

NK92 細(xì)胞的培養(yǎng)方法參照ATCC 的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)（https：//www.atcc.org/products/all/CRL-2407.aspx#cul turemethod），按照培養(yǎng)條件不同分為2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組：組1 加100 U/mL IL-2，組2 加100 U/mL IL-2+10 U/mL IL-15［7］。K562 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 和DMEM 中。所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

按照試劑盒說明書，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK92 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL培養(yǎng)體系。96孔板四周加入PBS 以防止板中的細(xì)胞培養(yǎng)液蒸發(fā)。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間后，每孔分別加入10 μL CCK-8試劑，以100 μL細(xì)胞懸液+10 μL CCK-8體系進(jìn)行孵育。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳孵育時(shí)間，即在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，D（450 nm）實(shí)驗(yàn)組-D（450 nm）空白對(duì)照的值間接反映活細(xì)胞的數(shù)量?？瞻讓?duì)照指僅有培養(yǎng)液而未加細(xì)胞的孔。

1.2.3 EdU標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖

用培養(yǎng)基調(diào)整NK92細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL進(jìn)行EdU標(biāo)記，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定加入EdU的濃度為50 μmol/L，培養(yǎng)箱孵育2 h。經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min 和0.5%Triton X-100 通透5 min 處理后，每1×106個(gè)細(xì)胞加入500 μL現(xiàn)配的Click-iT反應(yīng)混合物避光染色30 min 后加入DAPI 室溫避光15 min 進(jìn)行核染色。使用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡檢測(cè)與分析EdU陽性的細(xì)胞占比［8］。

1.2.4 CFSE標(biāo)記法流式檢測(cè)細(xì)胞增殖

將NK92細(xì)胞用PBS洗滌1遍并重懸。2×106個(gè)/mL的NK92 細(xì)胞懸液加入1 μL 5 mmol/L 的CFSE 儲(chǔ)存液，配制5 μmol/L 的工作液。37 ℃避光孵育10 min后，加入4 ℃預(yù)冷的5 倍體積含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液終止染色，5 min后離心（300g5 min），并用PBS洗2遍后，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于CFSE 標(biāo)記后的不同時(shí)間點(diǎn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK92的平均熒光強(qiáng)度，擴(kuò)增后與擴(kuò)增前的平均熒光強(qiáng)度比值反映細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)［7-8］。

1.2.5 Calcein-AM/CellTracker Deep Red 活細(xì)胞染料雙標(biāo)流式法檢測(cè)細(xì)胞毒功能

用培養(yǎng)基將靶細(xì)胞K562 調(diào)整為1×106個(gè)/mL，分別加入Calcein-AM 至終濃度2 μmol/L、CellTracker Deep Red Dye 至終濃度0.1 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min后，PBS清洗2遍后用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，加入96孔U型底板，每孔加入100 μL；按照不同效靶比加入效應(yīng)細(xì)胞，并定容至200 μL。將培養(yǎng)板置于1 000 r/min 離心1 min，放入37 ℃培養(yǎng)箱靜置4 h 進(jìn)行殺傷后，吹勻細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀上樣，注意進(jìn)樣相同體積數(shù)的分組樣品。雙陽性細(xì)胞群為剩余活的靶細(xì)胞。設(shè)置陽性對(duì)照：標(biāo)記過的靶細(xì)胞不加效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞毒性（%）=（空白對(duì)照讀數(shù)-實(shí)驗(yàn)組讀數(shù)）/空白對(duì)照讀數(shù)×100%［9］。

1.2.6 LDH釋放法檢測(cè)細(xì)胞毒功能

根據(jù)效靶比準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞數(shù)。將靶細(xì)胞的密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，取100 μL加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)不同效靶比加入效應(yīng)細(xì)胞，定容至200 μL；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton X-100各100 μL，放入培養(yǎng)箱中4 h。然后將96孔培養(yǎng)板以250g離心5 min，每孔吸取上清100 μL置于平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)5 min，每孔加入30 μL HCl（1 mol/L），在酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定吸光度值。按下式計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞毒活性。效應(yīng)細(xì)胞毒性（%）=［反應(yīng)孔D（490 nm）-自然釋放孔D（490 nm）/最大釋放孔D（490 nm）-自然釋放孔D（490 nm）］×100%［10］。

1.2.7 熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞毒功能

將K562 細(xì)胞的密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL。然后鋪96 孔板，每孔加靶細(xì)胞懸液100 μL，按照不同效靶比分別加入效應(yīng)細(xì)胞，空白對(duì)照不加效應(yīng)細(xì)胞，并定容至200 μL。放置培養(yǎng)箱4 h 后。按照每孔50 μL 用量，將2 mg/mL ATP 溶液與300 ng/mL 熒光素鈉溶液按照1∶3配制發(fā)光底物混合液。取出孵育過后的96孔板，每孔加入50 μL 2%Triton X-100，吹打混勻室溫靜置5 min，再次吹打混勻后每孔吸出50 μL 轉(zhuǎn)移到黑色96 孔酶標(biāo)板，并加入50 μL 發(fā)光底物混合液，吹打混勻后5 min 內(nèi)用活體成像儀或FLUOstar Omega 多功能讀板機(jī)檢測(cè)熒光值。效應(yīng)細(xì)胞毒性=（空白組熒光值-實(shí)驗(yàn)組熒光值）/空白組熒光值×100%［11］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件及GraphPad Prism 5進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，均數(shù)間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。等級(jí)相關(guān)采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)熒光素酶法、LDH釋放法與活細(xì)胞染料雙標(biāo)流式法的關(guān)聯(lián)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 法、EdU 標(biāo)記法與CFSE 標(biāo)記法檢測(cè)兩組NK92細(xì)胞增殖能力

CCK-8法連續(xù)4 d檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖提示，組2的NK92增殖能力強(qiáng)于組1，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1A）；而EdU 標(biāo)記法與CFSE 標(biāo)記法提示，與組1 相比，組2 的NK92 增殖能力更強(qiáng)且差異顯著（P＜0.05，圖1B～E）?？梢钥闯觯瑢?duì)于懸浮免疫細(xì)胞，CCK-8法缺乏一定的靈敏度，并未檢測(cè)出兩組細(xì)胞間的增殖差異；而EdU 和CFSE 標(biāo)記法則相對(duì)靈敏。

2.2 3 種細(xì)胞毒性檢測(cè)方法檢測(cè)兩組NK92 細(xì)胞對(duì)K562的細(xì)胞毒性

以K562 為靶細(xì)胞，組1 和組2 的NK92 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，分別在效靶比為2.5∶1、5∶1和10∶1下，進(jìn)行4 h的共孵育。活細(xì)胞染料雙標(biāo)流式法能夠有效檢測(cè)出組1和組2效應(yīng)細(xì)胞在不同效靶比下的細(xì)胞毒性差異（P＜0.05，圖2A 和B）。同樣，熒光素酶法也能檢測(cè)出組1和組2效應(yīng)細(xì)胞在不同效靶比下的細(xì)胞毒性差異（P＜0.05，圖2C、D）。圖2E 顯示3 次LDH 釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在5∶1 與10∶1 效靶比下，兩組效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性差異顯著（P＜0.05）。隨后，為了驗(yàn)證3種殺傷檢測(cè)方法的一致性，以雙標(biāo)流式法的檢測(cè)值為標(biāo)準(zhǔn)參照，分別與熒光素酶法和LDH釋放法的檢測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，圖2F、G結(jié)果所示，這兩種方法的檢測(cè)值均與雙標(biāo)流式法的檢測(cè)值呈顯著相關(guān)性（rS=0.979 4，P＜0.001；rS=0.973 2，P＜0.001）。但相比另外兩種檢測(cè)方法，LDH 釋放法的隨機(jī)誤差較大，因此并未檢測(cè)出效靶比為2.5∶1時(shí)兩組細(xì)胞毒性的差異（圖2E，P＞0.05）。

圖1 3種增殖檢測(cè)方法結(jié)果與統(tǒng)計(jì)Figure 1 Results and statistics of three proliferation detection methods

3 討論

免疫效應(yīng)細(xì)胞的體外擴(kuò)增是過繼免疫治療臨床應(yīng)用研究最基礎(chǔ)的步驟。本研究通過具體實(shí)驗(yàn)和對(duì)文獻(xiàn)的系統(tǒng)總結(jié)，比較3 種常用的增殖檢測(cè)方法，3種檢測(cè)方法因?yàn)樵砩嫌袇^(qū)別而各有特點(diǎn)（表1）。CCK-8 法側(cè)重于細(xì)胞代謝活性，EdU 標(biāo)記法側(cè)重于直接檢測(cè)處于S期的細(xì)胞，而CFSE標(biāo)記法則側(cè)重于提供細(xì)胞分裂信息。如表1中拓展應(yīng)用所展示的，這3 種方法不僅可以檢測(cè)細(xì)胞增殖而且可以反映所測(cè)樣品的其他生物功能信息。如何有效選擇，需要綜合考量實(shí)驗(yàn)需求、實(shí)驗(yàn)室條件等多種因素。當(dāng)然本文未涉及的增殖檢測(cè)方法如增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）［12］、Ki67［13］等也都其特點(diǎn)和獨(dú)特的適用性，如檢測(cè)石蠟組織中細(xì)胞的增殖。

雖然傳統(tǒng)的51Cr釋放實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)細(xì)胞毒性功能的金標(biāo)準(zhǔn)［14］，但是這種方法有一些缺點(diǎn)，如與同位素預(yù)孵育所需的時(shí)間較長(zhǎng)，51Cr的自發(fā)釋放，特別是需要建立符合生物安全的同位素實(shí)驗(yàn)室，后期同位素耗材的處置，生物安全檢測(cè)，可能導(dǎo)致的環(huán)境污染等系列問題。因此，近年來不斷研發(fā)新的檢測(cè)方法來替代51Cr 釋放實(shí)驗(yàn)方法，包括本研究選用的作為“標(biāo)準(zhǔn)”的雙標(biāo)流式法［15］。比較實(shí)驗(yàn)表明本研究所選用的3種細(xì)胞毒性檢測(cè)方法均具有較好的檢測(cè)效果，且具有很高的一致性，但也各有優(yōu)劣（表2）。因此，對(duì)于靶細(xì)胞為懸浮細(xì)胞的，建議首選雙標(biāo)流式法，貼壁靶細(xì)胞可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件及需求選擇熒光素酶法或LDH釋放法。

圖2 3種細(xì)胞毒性檢測(cè)方法結(jié)果與分析Figure 2 Results and analysis of three cytotoxicity detection methods

總之，本研究不僅在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕显敿?xì)對(duì)比研究了3 種增殖和3 種細(xì)胞毒性功能檢測(cè)方法，而且在實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上系統(tǒng)總結(jié)了各類方法的原理、特點(diǎn)、適用性和實(shí)踐應(yīng)用時(shí)的注意點(diǎn)。因此，需要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件、實(shí)驗(yàn)對(duì)象與目的等多種因素，在追求穩(wěn)定、精準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化的目標(biāo)下，綜合考慮后選擇適合實(shí)驗(yàn)體系的檢測(cè)方法。

表1 3種增殖檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of three proliferation detection assays

表2 3種細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的比較Table 2 Comparison of three kinds of cytotoxicity detection assays