侯德強，白 寧，魏子程，程 洋，劉彥魁，湯根兄

1江南大學附屬醫(yī)院口腔科，江蘇 無錫 214000；2江南大學無錫醫(yī)學院公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學系，江蘇 無錫 214000；3江南大學附屬醫(yī)院病理科，江蘇 無錫 214000；4南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院口腔科，江蘇 南京 210008

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，約60%的患者發(fā)生局部復發(fā)，5年生存率較差［1］。臨床亟需可用于OSCC診斷和治療的特異性預后標志物。白細胞分化抗原109（cluster of differentiation 109，CD109）是一種糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬于α2-巨球蛋白/補體家族的成員。CD109 是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的協(xié)同受體，可調(diào)節(jié)TGF-β受體的內(nèi)吞和降解，從而抑制TGF-β信號通路［2］。CD109 對TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)很可能影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。本研究通過檢測口腔組織中CD109 的表達，探究CD109 表達對OSCC 患者臨床病理特征和預后的關(guān)系，為OSCC 預后提供新的生物標志物。

1 材料和方法

1.1 材料

口腔組織取自2014 年1 月—2017 年12 月在江南大學附屬醫(yī)院口腔科接受手術(shù)或活檢的118例患者。口腔組織標本包括OSCC組織118例，癌旁組織32例。樣本采集前患者均未接受放化療。男76例，女42例，中位年齡34.5歲（范圍39～74歲）。臨床資料來源于患者病歷，根據(jù)第8 期美國癌癥聯(lián)合委員會（Alternate Joint Communications Center，AJCC）癌癥分期手冊確定OSCC的疾病臨床分期。本研究通過江南大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，并獲得所有患者的書面同意。

TRIzol試劑、SuperScript ⅣFirst-Strand試劑盒、SYBR 熒光定量PCR 試劑盒（Thermo 公司，美國），兔抗人CD109多克隆抗體（Abcam公司，英國），Histostain 鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）免疫組化染色試劑盒和蘇木素染料（北京中杉金橋生物科技有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（武漢純度生物科技有限公司）。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）

使用TRIzol 試劑提取冷凍組織中的總RNA，使用SuperScript ⅣFirst-Strand 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR 熒光定量PCR 試劑盒和ABI Prism 7500HT序列檢測系統(tǒng)進行定量擴增。引物序列如下：CD109上游5′-AAGCCAGTGAAAGGAGACGTA-3′，下游5′-CCAGGGGAAGATAGATCCAGG-3′，GAPDH 上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。以GAPDH為參照基因，計算CD109 mRNA相對表達量2-ΔΔCt。以上實驗重復3次。

1.2.2 免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色

組織芯片（tissue microarrays，TMA）由江南大學附屬口腔醫(yī)院病理科制作。所有組織標本均采用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。從供體蠟塊中收取組織芯柱（直徑2 mm），并將其置于石蠟中，制成新的組織包埋塊，4 μm 切片。采用SP 法對口腔TMA 樣本進行IHC 染色，一抗使用兔抗人CD109多克隆抗體（1∶200），詳細步驟參見Histostain SP 免疫組化染色試劑盒說明書。IHC 染色結(jié)果由兩名病理醫(yī)生在雙盲情況下評估。根據(jù)CD109 染色強度對樣本組織中的細胞染色進行評分，分別為0 分（陰性）、1 分（弱陽性）、2 分（中陽性）、3（強陽性）。最終染色評分=［3×強染色百分比+2×中度染色百分比+1×弱染色百分比］×100。最終染色評分范圍從0（無染色）到300（100%細胞染色強陽性）。根據(jù)OSCC患者的生存預后情況，使用Xtile軟件（http：//www.tissuearray.org）將CD109 表達情況分為高表達和低或無表達，計算出cutoff值為115。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以均值±標準差（）表示，兩獨立研究組間均數(shù)的比較采用成組t檢驗。對例數(shù)和率的比較采用Pearson 卡方檢驗計算CD109 與臨床病理特征的相關(guān)性。采用Kaplan Meier 法分析累計生存率。建立Cox 比例風險回歸模型，進行單因素和多因素分析，先進行單因素分析，對P＜0.01的因素再進行多因素分析，確定預后因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CD109 mRNA在OSCC組織中高表達

采用qRT-PCR 檢測25 例OSCC 組織及對應(yīng)癌旁組織中CD109 mRNA 的表達水平。結(jié)果顯示，OSCC 組織中CD109 mRNA 的表達量顯著高于癌旁組織（P＜0.05，圖1）。

2.2 CD109蛋白在OSCC組織中高表達

IHC 檢測CD109 蛋白在OSCC 組織和口腔癌旁組織中的表達。結(jié)果顯示，定位于細胞膜的CD109在OSCC 組織中高表達（圖2），OSCC 組織中CD109的高表達率為59.32%（70/118），高于癌旁組織（18.75%，6/32）（表1）。

2.3 OSCC中CD109表達與臨床特征的相關(guān)性

圖1 CD109 mRNA在OSCC組織及癌旁組織中的表達Figure 1 Expression of CD109 mRNA in OSCC tissues and paracancerous tissues

圖2 OSCC組織及癌旁組織中CD109蛋白的表達（IHC）Figure 2 CD109 protein expression in OSCC tissues and paracancerous tissues（IHC）

表1 CD109在OSCC組織及癌旁組織中的表達Table 1 CD109 expressions in OSCC tissues and paracancerous tissues［n（%）］

分析OSCC組織中CD109表達與病理參數(shù)的相關(guān)性。CD109表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.968，P=0.019）、遠處轉(zhuǎn)移（χ2=6.681，P=0.007）和AJCC 分期（χ2=4.189，P=0.031）顯著相關(guān)，而與性別、年齡、吸煙、分化程度或腫瘤大小無相關(guān)性（表2）。

2.4 OSCC中CD109表達與患者預后的關(guān)系

進行單因素和多因素分析以確定OSCC患者的預后因素。單因素分析顯示，CD109 表達（P＜0.001）、腫瘤大?。≒=0.041）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.018）和AJCC 分期（P＜0.001）與OSCC 患者的總生存期顯著相關(guān)。多因素分析顯示CD109 高表達（HR：1.182，95%CI：1.325～2.574，P＜0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR：1.308，95% CI：1.147～1.718，P=0.015）和AJCC 分期（HR：1.136，95%CI：1.028～1.360，P=0.032）是OSCC 患者的獨立預后因素（表3）。Kaplan-Meier 生存曲線證實CD109高表達與較短的總生存期相關(guān)（圖3）。

表2 CD109表達與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationships between CD109 expression level and clinicopathological characteristics of OSCC patients

3 討論

CD109是一種錨定糖基磷脂酰肌醇的細胞表面糖蛋白，最初是通過針對原始淋巴/髓系KG1a 的單克隆抗體檢測到的細胞表面抗原［4］。研究表明，CD109表達于CD34+骨髓單核細胞、間充質(zhì)干細胞、T淋巴母細胞、凝血酶激活的血小板、白血病原巨核細胞和內(nèi)皮細胞，但在新鮮外周血白細胞和正常骨髓白細胞中不表達［5-6］。研究還顯示，CD109攜帶雙等位基因血小板特異性同種異體抗原Gov，與血小板輸注困難、輸注后紫癜和新生兒同種免疫性血小板減少有關(guān)［5］。

表3 單變量和多變量分析檢測OSCC患者總生存期的預后因素Table 3 Univariate and multivariable analysis of prognostic factors for overall survival in OSCC patients

圖3 CD109表達與OSCC患者總體生存率的關(guān)系Figure 3 The relationship between CD109 expression and overall survival rate of OSCC patients

癌變是一個多階段過程，基因、蛋白質(zhì)及其他分子在該過程中發(fā)生了一系列變化，可作為有臨床價值的腫瘤分子標志。癌細胞特異性膜蛋白被認為是最合適的生物標志物，有助于了解腫瘤進展、開發(fā)診斷工具和確定新治療靶點。除乳腺、淚腺、唾液腺的肌上皮細胞、前列腺基底細胞和支氣管上皮外，CD109在大多數(shù)正常的人體組織低表達或不表達［7］，而在許多類型的腫瘤中高表達，如肺癌［8］、移行細胞癌［9］、胰腺癌［10］、惡性黑色素瘤［11］、食管鱗狀細胞癌［12］等。因此，CD109 是具有潛在研究價值的腫瘤分子標志物。

本研究結(jié)果表明，OSCC 組織中CD109 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Hagiwara等［13］在OSCC和癌前病變中觀察到CD109的高表達，提示CD109在預測癌前病變向口腔癌轉(zhuǎn)變中的作用，但并未分析CD109表達與其他病理特征和患者預后的關(guān)系。同樣，Dong等［14］發(fā)現(xiàn)CD109在膀胱鱗狀細胞癌和腺鱗癌中表達，但在腺癌或正常膽囊組織中不表達。與腺癌、大細胞癌和小細胞癌相比，CD109在肺鱗狀細胞癌中表達更為頻繁［15］。CD109在體外正向調(diào)控乳腺癌細胞的增殖，三陰性乳腺癌中CD109蛋白表達明顯高于非三陰性乳腺癌［16］。以上證據(jù)表明CD109在腫瘤癌變過程中發(fā)揮了重要作用，但在腫瘤進展過程中發(fā)揮的作用及機制仍需進一步探究。本研究分析了118例OSCC組織及其相關(guān)臨床資料，以探討CD109 表達與臨床病理特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示CD109的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和AJCC分期顯著相關(guān)，CD109高表達在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移或AJCC（Ⅲ+Ⅳ）期患者中更為常見。這些結(jié)果表明CD109可能參與了OSCC的轉(zhuǎn)移。

目前關(guān)于CD109 表達對癌癥患者預后影響的研究結(jié)果存在矛盾。在黏液纖維肉瘤、軟組織肉瘤和肝細胞癌中，CD109 高表達與較差的預后相關(guān)［3，17］。此外，在彌漫大B細胞淋巴瘤患者中，CD109高表達與1 年生存率低顯著相關(guān)［18］，而CD109 在移行細胞癌患者中的表達與較好的預后相關(guān)［10］。本研究中單因素Cox回歸分析顯示CD109表達、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移、AJCC 分期與OSCC 患者生存期相關(guān)。多因素分析進一步證實CD109表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC 分期是影響OSCC 患者預后的獨立因素。Kaplan-Meier 生存曲線證明了CD109水平高預示著較短的總生存期。以上結(jié)果表明，CD109 表達水平與OSCC患者預后密切相關(guān)。

綜上所述，本研究證明了CD109 在OSCC 組織中高表達，且CD109高表達的OSCC患者預后較差，證實了CD109與OSCC的發(fā)生發(fā)展及預后有一定相關(guān)性。CD109 有望成為新的OSCC 預后標志物，但其在OSCC中的作用機制仍需進一步研究。