楊彩霞，陸 超

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，江蘇 南京 210029

急性T 細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血?。═-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL），是惡性程度較高的血液?。?］，由于逐漸累積的基因突變破壞了正常的胸腺細(xì)胞發(fā)育過程，包括細(xì)胞生長、增殖、存活和分化的正?？刂?，導(dǎo)致T 細(xì)胞祖細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化［2］。染色質(zhì)解旋酶DNA 結(jié)合蛋白4（recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4，CHD4），屬于核小體重構(gòu)和組蛋白脫乙酰酶復(fù)合體的重要成員之一［3］，涉及許多致癌過程，與表觀遺傳密切相關(guān)，包括控制細(xì)胞周期進(jìn)展，加速實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移，發(fā)動和維持多種腫瘤抑制基因沉默等［4-6］。CHD4在T細(xì)胞發(fā)育過程中積極參與轉(zhuǎn)錄激活和抑制［7］，CHD4可能對于T-ALL 的發(fā)生發(fā)展很重要，但是具體的影響以及作用機(jī)制目前還不清楚。因此，本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測和CCK-8檢測探討干擾CHD4基因表達(dá)對T-ALL 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，通過構(gòu)建人CHD4基因啟動子重組質(zhì)粒，進(jìn)一步探討CHD4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為了解T-ALL的發(fā)病機(jī)制提供新視角。

1 材料和方法

1.1 材料

T-ALL 細(xì)胞（Jurkat）和人胚胎腎T 細(xì)胞（HEK 293T）均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。pGL3-Basic、內(nèi)參報告基因質(zhì)粒pRL-TK由本實(shí)驗(yàn)室保存。基因組DNA 提取試劑盒、感受態(tài)大腸埃希菌（北京天根公司）。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素（Multicell公司，美國），進(jìn)口胎牛血清（Scien Cell公司，美國）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物公司），細(xì)胞周期檢測試劑盒、CCK-8 檢測試劑盒（南京福麥斯公司）；流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司，美國）；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BglⅡ、T4 DNA連接酶（Thermo Fisher 公司，德國）；rTaq DNA 聚合酶、DNA 聚合酶TaKaRa LA Taq and GC buffer、雙熒光素酶報告檢測試劑盒、實(shí)時定量PCR試劑盒（TaKa-Ra公司，日本）；5000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、核心啟動子區(qū)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒pGL-mNF-κB（北京擎科公司），NF-κB 表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-NF-κB（吉凱基因）；質(zhì)粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒（Omega 公司，美國），TRIzol、LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美國）；雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（Promega 公司，美國）；CHD4、GAPDH 和NF-κB 兔單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（Biosharp 公司，美國），PVDF（聚偏氟乙烯）膜（GE Healthcare 公司，美國）；EZ-Magna CHIP tm A試劑盒（Millipore公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Jurkat 細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)基，HEK293T 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)基均含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以及1%青霉素（100 U/mL）-鏈霉素（100 mg/mL）溶液。兩種細(xì)胞均置于具有一定濕度、37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長對數(shù)期進(jìn)行。

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)檢測Jurkat 細(xì)胞凋亡百分率。經(jīng)qRT-PCR 分析確定siRNA-CHD4 轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞24 h 后敲低效率最高，所以轉(zhuǎn)染24后收集細(xì)胞，PBS洗滌3 次，加入V-APC 和7-AAD 各5 μL，室溫避光15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞周期檢測：采用細(xì)胞周期檢測試劑盒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-CHD4 24 h后收集，95%乙醇4 ℃固定過夜，PBS洗滌3次，PI染色，37 ℃水浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 CCK-8增殖分析

將Jurkat 細(xì)胞以4×103個/孔鋪于96 孔板，每組5 個復(fù)孔，加10 μL CCK-8 試劑，在5%CO2、37 ℃條件下孵育2 h后用酶標(biāo)儀測量每個孔在450 nm波長下的吸光度值，相同條件下連續(xù)測量4 d。

1.2.4 CHD4基因候選啟動子區(qū)生物信息學(xué)分析及克隆

CHD4 基因候選啟動子區(qū)生物信息學(xué)分析：從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）GenBank 中獲取人CHD4 基因序列（編號：NC_000012.12）。利用UCSC 網(wǎng)站（http：//genome.ucsc.edu/）進(jìn)行對比，取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp，下游100 bp 通過Neural Network Promoter Prediction（http：//fruitfly.org/cgi bin/seq_tools/promoter.pl）進(jìn)行預(yù)測；再使用JASPAR（jaspar.genereg.net/）數(shù)據(jù)庫5.0版對CHD4基因核心啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

引物設(shè)計：以預(yù)測的CHD4 基因候選啟動子序列為模板，用Prime5.0設(shè)計引物，再對該區(qū)域5′側(cè)翼區(qū)截短序列設(shè)計引物。上下游引物5′端分別加入限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。共用下游引物：5′-GGAAGATCTGAGGGGCGTCTCTTTG-3′。上游引物分別是P1（pGL-1974/+117）：5′-CGGGGTACCAGTATCATCTTCCAGCCTCTAGA-3′；P2（pGL-918/+117）：5′-CGGGGTACCTGTGGGGCGACAGTAGGG-3′；P3（pGL-428/+117）：5′-CGGGGTACCAGGGTTAGTTGCAAAAGGTCTG-3′；P4（pGL-233/+117）：5′-CGGGGTACCTGCCCAGGTGACGCGCGCGC-3′；P5（pGL-13/+117）：5′-CGGGGTACCGCCGGAGCCATTTTCCCC-3′（下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)堿基）。引物合成由上海英駿公司完成。

Jurkat細(xì)胞全基因組DNA提?。篔urkat細(xì)胞全基因組DNA 提取按照基因組DNA 提取試劑盒的說明書操作。

質(zhì)粒構(gòu)建：以Jurkat細(xì)胞全基因組DNA為模板，根據(jù)TaKaRa LA TaqandGC buffer 催化酶說明書條件進(jìn)行催化擴(kuò)增，條件如下：94 ℃1 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃2 min，30個循環(huán)。用1%的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。切膠回收試劑盒回收瓊脂糖電泳產(chǎn)物。回收產(chǎn)物與pGL3-Basic 載體均用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BglⅡ在37 ℃水浴條件下進(jìn)行雙酶切1 h，酶切產(chǎn)物用切膠回收純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物用T4 DNA連接酶在37 ℃水浴中連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化條件為4 ℃3 min，42 ℃水浴1 min 20 s，4 ℃30 min。取轉(zhuǎn)化好的菌液加入1 mL不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，置于37 ℃搖床倒置擴(kuò)增1 h，將擴(kuò)增好的菌液涂于含有氨芐青霉素的固體LB 培養(yǎng)板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。在長出菌落的LB板上挑取單克隆菌落，加入含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床倒置擴(kuò)增3 h，以擴(kuò)增后的菌液為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件同前。用1%瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物電泳30 min，選取陽性菌液進(jìn)行測序，將經(jīng)測序鑒定正確的菌液加入含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中于37 ℃搖床擴(kuò)增過夜，擴(kuò)增后的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒提取含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)記為P1（pGL-1974/+117）。以構(gòu)建成功的質(zhì)粒序列為模板，共用同一下游引物，上游引物分別為P2～P5 進(jìn)行PCR，構(gòu)建CHD4 基因候選啟動子區(qū)5′側(cè)翼區(qū)截短序列質(zhì)粒，方法同上。

1.2.5 基因敲低分析

雙鏈siRNA的設(shè)計與合成由廣州銳博生物科技有限公司完成，siRNA 序列和陰性對照序列如下：siRNA-CHD4：5′-GCATGTCCTTACTAGAATT-3′（正義鏈），5′-TAATTCTAGTAAGGACATGC-3′（反義鏈）；siRNA-NF-κB：5′-GCACCTAGCTGCCAAAGAA-3′（正義鏈），5′-TTCTTTGGCAGCTAGGTGC-3′（反義鏈）；陰性對照：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′（正義鏈），5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′（反義鏈）。

1.2.6 瞬時轉(zhuǎn)染

Jurkat 細(xì)胞以2×105個/孔鋪12 孔板，12 h 后以500 ng/mL siRNA或表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收取RNA，48 h后收取蛋白質(zhì)。啟動子雙熒光素酶檢測，轉(zhuǎn)染前18 h將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞置于96孔板（1×104個/孔），使用LipofectamineTM3000將100 ng CHD4 啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒和4 ng pRL-TK 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。18 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。

1.2.7 免疫印跡法（Western blot）

用8%～12%的SDS-PAGE 電泳分離總蛋白，在轉(zhuǎn)移緩沖液中將樣品電轉(zhuǎn)移到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF 膜2 h，CHD4、GAPDH、NF-κB 抗體在搖床上孵育目的條帶4 ℃過夜。TBST緩沖液充分洗滌條帶3次，將這些條帶與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育2 h，TBST緩沖液充分洗滌條帶3次后用電化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)觀察條帶。

1.2.8 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

用TRIzol 法提取總RNA，用Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time Kit 系列逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA 為擴(kuò)增模板，用實(shí)時定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列：GAPDH 5′-GATCATCAGCAATGCCTCCT-3′（正義鏈），5′-TGAGTCCTTCCACGATACCA-3′（反義鏈）；CHD4 5′-CAAAATGGCGGGAGTTCAGTA-3′（正義鏈），5′-CTCTCCACCACAGCTACCG-3′（反義鏈）；NF-κB 5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′（正義鏈），5′-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3′（反義鏈）。qRT-PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；90 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40 次；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)儀器為Step One Plus Quantitative Realtime PCR System。記錄各反應(yīng)孔對應(yīng)Ct值以計算mRNA 相對表達(dá)量。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，目的基因?yàn)槿薈HD4，CHD4 mRNA 的相對表達(dá)量（2-ΔΔCt）=CHD4 mRNA 拷貝數(shù)/GAPDH mRNA 拷貝數(shù)；ΔΔCt=（Ct刺激組CHD4-Ct刺激組GAPDH）-（Ct對照組CHD4-Ct對照組GAPDH）。設(shè)對照組mRNA 相對表達(dá)量為1。

1.2.9 雙熒光素酶活性測定

收集96 孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基，用1×PBS洗滌3次，棄去PBS加入1×裂解緩沖液，室溫振蕩30 min 充分裂解細(xì)胞。按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，每孔取20 μL裂解液，分別加入20 μL底物緩沖液和20 μL終止緩沖液，混合后分別測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值。

1.2.10 CHIP實(shí)驗(yàn)檢測

使用EZ-Magna CHIP tm A 試劑盒，根據(jù)其說明書進(jìn)行分析。將1×107個Jurkat細(xì)胞在1%甲醛中室溫固定10 min，超聲檢測細(xì)胞裂解產(chǎn)物，產(chǎn)生200～1 000 bp 的DNA 片段。然后用anti-IgG 抗體、anti-NF-κB 抗體（Abcam ab194729）和anti-acetyl 組蛋白H3抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。經(jīng)反向交聯(lián)和DNA純化后，使用SYBR Green 進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物如下：上游引物5′-GGGTTGGAGTTGGTTGAGGT-3′，下游引物5′-GGGTTGGAGTTGGTTGAGGT-3′。qRT-PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；90℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40次；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)儀器為Step One Plus Quantitative Realtime PCR System。記錄各反應(yīng)孔對應(yīng)Ct值以計算mRNA 相對表達(dá)量。用rTaq DNA 聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，熱循環(huán)35 次；最后72 ℃延伸5 min。取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad Prism7.0 和SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHD4基因促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖、抑制其凋亡

通過qRT-PCR 和Western blot 檢測siRNACHD4的敲低效率。CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHD4對Jurkat細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測，與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-CHD4 的Jurkat 細(xì)胞凋亡率（55%～60%）明顯上升。說明CHD4對Jurkat細(xì)胞的凋亡具有抑制作用。與對照組比較，轉(zhuǎn)染siRNACHD4 的Jurkat 細(xì)胞G0/G1 期比例顯著升高，而S 期比例下降7%～10%（圖1）。

2.2 生物信息學(xué)分析人CHD4基因候選啟動子區(qū)域

首先在NCBI 網(wǎng)站及UCSC 網(wǎng)站比對確認(rèn)CHD基因的啟動子區(qū)域。運(yùn)用Promoter 2.0 Prediction Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約2 000 bp、下游100 bp區(qū)域，結(jié)果表明該區(qū)域具有啟動子活性，再通過Neural Network Promoter Prediction（http：//fruitfly.org/cgibin/seq_tools/promoter.pl）對該區(qū)域進(jìn)行預(yù)測（圖2）。

2.3 人CHD4基因候選啟動子區(qū)擴(kuò)增

CHD4基因預(yù)測啟動子經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示有特異性條帶出現(xiàn)，長度為2 091 bp，與預(yù)測片段大小相符（圖3）。

2.4 人CHD4 基因候選啟動子區(qū)5′側(cè)翼區(qū)截短序列質(zhì)粒構(gòu)建

各截短序列質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ、BglⅡ酶切，可見pGL3-Basic載體片段（4 818 bp）和長度分別為2 091、1 035、546、350、130 bp的序列片段（圖4）。

2.5 人CHD4基因候選啟動子區(qū)活性檢測

在HEK293T 細(xì)胞和Jurkat 細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶檢測,發(fā)現(xiàn)與陰性對照質(zhì)粒pGL-3Basic相比，重組質(zhì)粒P1（pGL-1947/+117）的熒光素酶相對活性明顯增高，P1～P4的活性無明顯差異（P＞0.05），P5（pGL-13/+117）與其他截短節(jié)段質(zhì)粒相比，啟動子活性明顯降低（P＜0.05），與陰性對照pGL-3Basic相近。因此認(rèn)為,CHD4基因啟動子最小活性區(qū)域位于其5′側(cè)翼區(qū)的-233 bp至-13 bp（圖5）。

圖1 人CHD4基因促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的增殖及抑制其凋亡Figure 1 CHD4 induces proliferation and inhibits apoptosis in Jurkat cells

圖2 生物信息學(xué)分析人CHD4基因候選啟動子區(qū)域Figure 2 Analysis of candidate promoter region of human CHD4 gene

圖3 人CHD4基因候選啟動子區(qū)擴(kuò)增Figure 3 Amplification of the candidate promoter region of human CHD4 gene

2.6 人CHD4 基因啟動子核心區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

使用JASPAR（jaspar.genereg.net/）數(shù)據(jù)庫5.0版，發(fā)現(xiàn)在-233～-13 bp之間存在NF-κB、MZF1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖6）。

2.7 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合到CHD4基因啟動子區(qū)

為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與CHD4 啟動子區(qū)是否可以結(jié)合，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（CHIP），根據(jù)啟動子區(qū)的NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計了相應(yīng)的引物。PCR 證實(shí)NF-κB 結(jié)合的基因組DNA包含CHD4 啟動子區(qū)的NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域。因此，在Jurkat 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 能與人CHD4基因啟動子結(jié)合（圖7）。

圖4 人CHD4基因候選啟動子區(qū)5′側(cè)翼區(qū)截短序列質(zhì)粒雙酶切鑒定Figure 4 Identification of the 5′ flanking region of the candidate promoter region of human CHD4 gene in luciferase report gene recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.8 NF-κB對人CHD4基因的啟動子活性具有正向調(diào)控作用

首先用siRNA-NF-κB和pcDNA3-NF-κB分別轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞，分析其轉(zhuǎn)染效率。用結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒、siRNA-NF-κB 和pcDNA3-NF-κB 分別瞬時轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞。檢測其熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)抑制NFκB 后，CHD4 基因的啟動子活性下降；反之，當(dāng)過表達(dá)NF-κB 時，CHD4 基因的啟動子活性明顯增加。同時，與野生型相比，轉(zhuǎn)染含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變序列的質(zhì)粒后，CHD4 基因啟動子活性明顯下降，這些結(jié)果說明人類CHD4基因啟動子活性受NFκB的正向調(diào)控（圖8）。

圖5 人CHD4基因候選啟動子區(qū)活性檢測Figure 5 Relative luciferase activities of candidate plasmids of CHD4 promote

圖6 人CHD4基因啟動子核心區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Figure 6 Putative consensus binding sites of transcription factors in CHD4 promote

3 討論

T-ALL的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因突變的多階段過程，其中最顯著的變化之一是對細(xì)胞凋亡的抑制。雖然已經(jīng)在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化和促進(jìn)其凋亡方面做了很多努力，但是治愈率并沒有顯著提高［8］。CHD4是NuRD的核心亞基，參與許多疾病的發(fā)展和進(jìn)展，包括腫瘤發(fā)生、病毒感染、神經(jīng)退行性變等，但其在這些疾病中的作用尚未完全了解［5，9］。在某些情況下，它通過對抗染色質(zhì)重構(gòu)來對抗轉(zhuǎn)錄活性因子［6，10］。在某些條件下CHD4可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，與促癌功能相關(guān)［11］。鑒于這些調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的特點(diǎn)，我們猜測CHD4可能與T-ALL細(xì)胞凋亡有關(guān)。

圖7 NF-κB與CHD4基因啟動子區(qū)最小活性區(qū)域結(jié)合Figure 7 NF-κB binds to the minimal promoter of CHD4 in vivo

CCK-8 檢測、流式細(xì)胞計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CHD4 可以促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，與之前的一些研究結(jié)果一致，異常表達(dá)的CHD4 在T-ALL 中起著原癌基因的作用［12］?；虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控是由啟動子決定的。啟動子通過與一些蛋白質(zhì)結(jié)合來決定基因的活性，這些蛋白質(zhì)被稱為影響基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子?；騿幼硬糠值母淖儗?dǎo)致基因表達(dá)調(diào)控紊亂，常導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［13-14］。因此，本研究分析了CHD4基因啟動子區(qū)域，以更好地理解CHD4在T-ALL 中的內(nèi)在機(jī)制。本研究克隆了其啟動子，分析了Jurkat 和HEK293T 細(xì)胞的啟動子區(qū)域結(jié)構(gòu)和啟動子活性。通過產(chǎn)生一系列5′缺失質(zhì)粒，確定了核心啟動子相對于TSS 位于-233/-13 bp 區(qū)域。為進(jìn)一步分析CHD4基因啟動子最小活性區(qū)域內(nèi)重要的調(diào)控元件，本研究通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)NF-κB、MZF1 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。NFκB在多種信號通路中與腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，其中細(xì)胞增殖和凋亡的信號通路被認(rèn)為是最重要的通路之一［15］。已有研究表明，NF-κB 與成人T-ALL 細(xì)胞的激活有關(guān)［16］。因此，本研究進(jìn)一步通過點(diǎn)突變技術(shù)分析CHD4 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)NF-κB對CHD4基因的啟動子活性具有正向調(diào)控作用；通過熒光素酶測試發(fā)現(xiàn)NF-κB 表達(dá)降低時，人CHD4 啟動子活性降低，而NF-κB 表達(dá)增高時，CHD4啟動子活性明顯增高。染色質(zhì)共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與CHD4 基因啟動子相結(jié)合，進(jìn)一步分析了CHD4 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究T-ALL提供了新方向。

圖8 NF-κB對人CHD4基因的啟動子活性具有正向調(diào)控作用Figure 8 NF-κB positively regulates the promoter activity of CHD4