劉 雪，馬春梅，王冰微，楊 碩*

1南京醫(yī)科大學免疫學系，江蘇 南京 211166；2南京中醫(yī)藥大學藥理學系，江蘇 南京 210023

肥胖目前已成為全球關(guān)注的重大健康問題，研究報道全球超過30%的人口有肥胖問題。肥胖會誘發(fā)心血管疾病、高血壓、糖尿病和腫瘤等多種疾病。多項研究表明腸道菌群異常、炎癥及代謝異常會誘發(fā)肥胖及肥胖相關(guān)疾病，但是其具體發(fā)病機制仍有待進一步闡明［1-3］。并且，目前尚無有效抑制肥胖發(fā)生的手段，因此對于肥胖發(fā)生機制及治療方法的探究成為全球科學家需要解決的問題。

巨噬細胞是連接固有免疫和適應性免疫的重要免疫細胞，廣泛分布于多種組織和器官，已有多項研究表明巨噬細胞參與代謝類疾病、心血管疾病及腫瘤等多種疾病的調(diào)控反應［4］。異質(zhì)性和可塑性是巨噬細胞的重要特征，在外界不同環(huán)境因素刺激下，巨噬細胞表現(xiàn)出不同的分型。主要包括經(jīng)典活化型（促炎型）M1 型和替代活化型（抑炎型）M2 型，M1型主要受脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和干擾素（interferon，IFN）-γ激活，分泌促炎細胞因子白介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等，主要發(fā)揮促炎、殺菌及抗原遞呈等功能，M2 型主要受IL-4 和IL-13 刺激激活，高表達精氨酸酶1（arginase-1，ARG1）、發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域1（found in inflammatory zone 1，F(xiàn)iZZ1）蛋白、甘露糖受體C1 樣蛋白1（mannose receptor C type 1 like protein 1，MRC1），主要起抑炎、組織修復等功能［5］。近年來，多項研究證實脂肪組織巨噬細胞（adipose tissue macrophage，ATM）在調(diào)控代謝炎癥過程中發(fā)揮重要作用［6］，已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激琥珀酸受體1（succinate receptor 1，SUNCR1）可以通過調(diào)控脂肪相關(guān)巨噬細胞極化來調(diào)控肥胖的發(fā)生［7］。近期一系列研究提示巨噬細胞極化在調(diào)控脂肪發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

近年來研究表明，肥胖及肥胖相關(guān)疾病與炎癥小體的功能異常有關(guān)。炎癥小體是機體先天免疫系統(tǒng)細胞內(nèi)多分子復合體識別受體，可以識別多種體內(nèi)外信號［8］。炎癥小體主要由核心蛋白NLR（NOD-like receptor）或PYHIN（pyrin and HIN domaincontaining）分子、接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）以及蛋白酶Caspase-1 和Caspase-11 組成。炎癥小體核心分子感受病原和體內(nèi)危險信號刺激后，可招募接頭蛋白和蛋白酶組裝成多分子蛋白復合體，進而誘導蛋白酶激活剪切炎癥因子IL-1β和IL-18前體形成成熟形式，成熟形式的IL-1β和IL-18分子隨后釋放到細胞外激活炎癥反應。研究報道抑制性炎癥小體NOD樣受體家族（NOD-like receptor，NLR）的NLRP12 可以通過調(diào)控腸道菌群穩(wěn)態(tài)抑制高脂誘導的小鼠肥胖的產(chǎn)生［9］。另外，研究證實炎癥小體NLRP1 和NLRP3 也參與抑制高脂誘導的小鼠肥胖及胰島素抵抗［10］。炎癥小體黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）屬于干擾素誘導的含有HIN-20結(jié)構(gòu)域蛋白家族的一員。近年來，多項研究證實炎癥小體AIM2在調(diào)控病毒感染、腫瘤發(fā)生及動脈粥樣硬化產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用［11-13］，但是其在代謝及肥胖相關(guān)疾病中的調(diào)控作用尚不明確。

本研究利用高脂誘導肥胖小鼠模型，著重探究炎癥小體AIM2在調(diào)控肥胖發(fā)生過程中的角色和功能，為臨床肥胖患者的診治提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

AIM2 全敲小鼠（Jackson 公司，美國），AIM2 條件敲除小鼠（北京百奧賽圖生物公司）；高脂飼料（北京欣晨夕生物公司）；葡萄糖（生工生物公司，美國）；胰島素（Invitrogen 公司，美國）；蘇木素和伊紅（Sigma 公司，美國）；血糖試紙（羅氏生物公司，美國）；APC-F4/80、FITC-CD-11b、PE-CY7-CD-86 流式抗體、PE-CD-206流式抗體，膠原酶Ⅱ（Thermo公司，美國）；DMEM 高糖培養(yǎng)基和血清（Gibco 公司，美國），TRIzol 試劑盒（Life 公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green（諾唯贊生物試劑公司，美國），引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型

所有小鼠（每籠飼養(yǎng)4只）置于正常光照條件下喂養(yǎng)，分為正常飲食組（普通飼料）和高脂飲食組（60%高脂飼料），高脂飲食組小鼠7 周齡時開始喂高脂飼料，連續(xù)15 周，期間每周稱小鼠體重。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會批準。

1.2.2 小鼠葡萄糖耐受和胰島素敏感性實驗

小鼠饑餓16 h 后，開始進行葡萄糖耐受實驗，腹腔注射葡萄糖（1.5 g葡萄糖/kg小鼠體重），尾尖取血，用羅氏血糖儀測小鼠血糖。血糖測定時間依次為0、15、30、60、90 min，小鼠饑餓6 h 后進行胰島素耐受實驗，腹腔注射胰島素（0.75 U/kg 小鼠體重），尾尖取血，用羅氏血糖儀測小鼠血糖。

1.2.3 骨髓來源的巨噬細胞分離與培養(yǎng)

取8～12 周齡的小鼠，處死后，分離小鼠大腿骨置于無菌PBS 的培養(yǎng)皿中，清除關(guān)節(jié)連接處的其他組織，并沿關(guān)節(jié)處分開。將干凈的骨頭轉(zhuǎn)移到新的帶有PBS 的皿中，剪開骨頭的末端。用含有培養(yǎng)基的5 mL注射器針頭插入骨頭的開口處，將骨髓吹入一個新的培養(yǎng)皿中。1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 mL RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，再加入20 mL 10%的L929培養(yǎng)基，接種到細胞培養(yǎng)瓶中。放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每2 天更換1 次新鮮的培養(yǎng)基。

1.2.4 巨噬細胞的刺激和極化

取出小鼠骨髓，將分化成熟的巨噬細胞按3×105個/孔接種到12 孔板，用含有10% L929 培養(yǎng)基的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，12 h 后，將培養(yǎng)基換為正常DMEM 培養(yǎng)基，分別用LPS（誘導巨噬細胞向M1樣巨噬細胞極化，濃度為200 ng/mL）和IL-4（誘導巨噬細胞向M2 樣巨噬細胞極化，濃度為20 ng/mL）刺激細胞，24 h后收集細胞，分別用流式抗體F4/80和CD86 標記M1 型巨噬細胞，用流式抗體F4/80 和CD206 標記M2 型巨噬細胞，進行流式檢測。并對M1 型巨噬細胞分泌的促炎細胞因子IL-6、TNF-α和iNOS，對M2 型巨噬細胞分泌的促炎細胞因子Arg1、Ym1、Mrc1進行基因表達分析。

1.2.5 流式細胞分析

將極化的巨噬細胞用消化酶37 ℃消化10 min后，加入培養(yǎng)基終止消化，收集細胞后，1 500 r/min離心5 min，去上清。加入PBS，5 000 r/min離心5 min，然后每個樣品加入100 μL含有流式抗體的染色液重懸，常溫避光染色30 min。5 000 r/min離心3 min，棄上清，加上染色液重懸，上機檢測。

1.2.6 HE染色

組織甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，再使用逐級降濃度酒精水化，無水酒精1～2 min，95%酒精1～2 min，80%酒精1～2 min，自來水洗。蘇木素液染5～10 min，自來水洗，1%鹽酸酒精分化0.5～1.0 min，流水沖洗15 min，酒精脫水，95%酒精1～2 min，無水酒精1～2 min，二甲苯透明，蓋玻片封片，等樹膠干燥后，顯微鏡下采集圖像，Image J 軟件計算細胞面積。

1.2.7 RNA提取與定量PCR分析

小鼠處死，收集小鼠附睪周圍脂肪組織并勻漿，經(jīng)過離心后，總RNA 由TRIzol 試劑盒提取后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Green Supermix（Vazyme 公司，美國）進行qRT-PCR。通過標準曲線方法計算基因的表達，并以Hprt為內(nèi)參基因?qū)⑵錁藴驶?。具體引物基因序列如下：AIM2上游引物5′-CTGAAAACTGCTCTGCTGCCT-3′，下游引物5′-TGCCACCATCTGTTTCTTCTGA-3′；FABP4 上游引物5′-GGGGCCAGGCTTCTATTCC -3′，下游引物5′ -GGAGCTGGGTTAGGTATGGG-3′；PPARγ上游引物5′-TCGCTGATGCACTGCCTATG-3′，下游引物5′-GAGAGGTCCACAGAG-CTGATT-3′；Hprt 上游引物5′-GTCCCAGCGTCGTGATTAGC-3′，下游引物5′-TGGCCTCCCATCTCCTTCA-3′；IL-6 上游引物5′-CTTGGGACTGATGCTGGTGAC-3′，下游引物5′-GCCATTGCACAACTCTTTTCTC-3′；TNF-α上游引物5′-TTCCCAAATGGCCTCCCT-3′，下游引物5′-TGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3′；iNOS 上游引物5′-AGGGAATCTTGGAGCGAGTTG-3′，下游引物5′-TGAGGGCTTGGCTGAGTGAG-3′；Arg1 上游引物5′-CACAGTCTGGCAGTTGGAAGC-3′，下游引物5′-TGGTTGTCAGGGGAGTGTTG-3′，Ym1 上游引物5′-CATTGGAGGATGGAAGTTTGG-3′，下游引物5'-GGTACTGCCAGTCCAGGTTGA-3′，Mrc1 上游引物5′-CTCAACCCAAGGGCTCTTCTAA-3′，下游引物5′-AAGGTGGCCTCTTGAGGTATGT-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，并以均值±標準差（）表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AIM2在高脂誘導的小鼠肥胖模型中的表達

為了探究AIM2在肥胖發(fā)生中的作用，分別給予野生型（WT）小鼠正常飲食和60%高脂飲食15周后，取小鼠性腺周圍脂肪組織，基因水平分析AIM2 的表達情況，結(jié)果顯示，在高脂誘導的肥胖小鼠中，AIM2表達顯著下調(diào)（圖1）。該結(jié)果提示AIM2對肥胖發(fā)生有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖1 AIM2在高脂誘導的小鼠肥胖模型中的表達分析Figure 1 AIM2 expression level analysis in obesity mouse induced by high-fat food

2.2 AIM2在小鼠肥胖發(fā)生過程中發(fā)揮保護作用

為了明確AIM2 在肥胖發(fā)生中的具體功能，對AIM2 敲除小鼠進行高脂飲食造模，對其體重、脂肪結(jié)構(gòu)、葡萄糖耐受及胰島素耐受情況進行分析。造模結(jié)果顯示，AIM2基因敲除小鼠體重增加水平顯著高于WT小鼠（圖2A）。小鼠性腺周脂肪組織HE染色結(jié)果表明，相比于WT 小鼠，AIM2 基因敲除小鼠的脂肪細胞明顯增大，脂肪細胞間炎性細胞浸潤顯著增多（圖2B、C）。并且AIM2基因敲除小鼠的葡萄糖抵抗能力以及胰島素敏感性都被破壞，小鼠出現(xiàn)了葡萄糖不耐受和胰島素抵抗（圖2D、E）。由于脂肪生成受多種脂肪生成相關(guān)蛋白的調(diào)控，我們分析了脂肪生成相關(guān)分子的基因表達變化，結(jié)果顯示AIM2缺失后，可以顯著誘導脂肪合成相關(guān)分子脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）和過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ）的上調(diào)表達（圖2F、G）。以上結(jié)果表明，AIM2在高脂誘導的小鼠肥胖發(fā)生過程中發(fā)揮保護作用，抑制小鼠肥胖的產(chǎn)生。

2.3 脂肪組織巨噬細胞中的AIM2調(diào)控高脂誘導的肥胖發(fā)生

圖2 AIM2抑制小鼠肥胖的發(fā)生Figure 2 AIM2 inhibits the occurrence of obesity in mice

前期研究顯示AIM2 在巨噬細胞中高表達，并且發(fā)現(xiàn)高脂造模后脂肪組織中巨噬細胞浸潤明顯增多，為了進一步探究AIM2 調(diào)控脂肪發(fā)生的作用機制，構(gòu)建了巨噬細胞（Cx3cr1-cre）AIM2 條件性敲除小鼠來明確巨噬細胞中的AIM2對高脂誘導的肥胖發(fā)生的影響。對同窩FLOX小鼠和條件敲除小鼠進行高脂飲食造模，與AIM2fl/fl小鼠相比，AIM2fl/flCx3cr1-Cre 小鼠體重增加更多（圖3A），與此相一致，病理結(jié)果顯示，AIM2 基因敲除小鼠脂肪細胞更大，冠狀結(jié)構(gòu)更少（圖3B、C）。并且AIM2fl/flCx3cr1-Cre小鼠對葡萄糖的耐受能力和對胰島素的抵抗能力顯著下降（圖3D、E）。另外，在巨噬細胞中特異性缺失AIM2 后，同樣可以顯著促進FABP4 和PPARγ的表達上調(diào)（圖3F、G）。上述結(jié)果揭示AIM2調(diào)控小鼠肥胖的發(fā)生可能是通過對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用的。

2.4 AIM2 通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化來調(diào)控脂肪組織形成

為了進一步明確AIM2 對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用，首先取出WT和AIM2基因敲除小鼠高脂造模后的性腺周脂肪組織，發(fā)現(xiàn)相比WT 小鼠，AIM2 基因敲除小鼠M1 型巨噬細細胞促炎細胞因子IL-6、TNF、iNOS 顯著上調(diào)表達，但是M2型巨噬細胞產(chǎn)生的抑炎細胞因子Arg1、Ym1、Mrc1 沒有顯著變化（圖4A、B）。同時，分離WT 小鼠和AIM2基因敲除小鼠的骨髓來源巨噬細胞，分別用M1 型巨噬細胞促炎極化因子LPS 和M2 型巨噬細胞抑炎極化因子IL-4刺激細胞。流式分析結(jié)果顯示AIM2 缺失后，促炎巨噬細胞（M1 樣巨噬細胞）比例顯著增加，但是不影響抑炎巨噬細胞（M2樣巨噬細胞）比例的改變（圖4C、D）。與此相一致，基因表達分析結(jié)果表明AIM2缺失后，M1型巨噬細胞標志分子IL-6、iNOS 顯著上調(diào)表達，M2 型巨噬細胞標志分子Arg1、Ym1 沒有顯著變化（圖4E～H）。以上結(jié)果表明，AIM2 缺失促進脂肪組織巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，提高促炎細胞因子表達水平，加重脂肪組織炎性程度，進而產(chǎn)生葡萄糖代謝異常，促進脂肪生長。

圖3 巨噬細胞中的AIM2抑制小鼠肥胖的發(fā)生Figure 3 AIM2 in macrophages inhibits the occurrence of obesity in mice

3 討論

慢性炎癥和免疫細胞在脂肪組織累積與肥胖密切相關(guān)，巨噬細胞是脂肪組織中最主要的炎性細胞。大量研究表明，當肥胖發(fā)生時，脂肪組織巨噬細胞大量浸潤，介導肥胖患者產(chǎn)生胰島素抵抗［14-15］。巨噬細胞有不同的表型，目前已有多項研究報道，在脂肪發(fā)生過程中，脂肪巨噬細胞經(jīng)歷從抗炎M2 型向促炎M1型轉(zhuǎn)換［16］。

炎癥小體AIM2 作為胞質(zhì)中DNA 識別感受器，在抵御細菌和病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。有文獻報道AIM2在銀屑病的病灶皮膚中表達明顯升高，并且也有研究表明AIM2 能調(diào)節(jié)皮膚干細胞的功能［17］。近期研究表明AIM2在腸道干細胞中可以通過調(diào)控AKT信號通路抑制腸道腫瘤的發(fā)生，并且不依賴于其炎癥小體的功能［18］。但是關(guān)于AIM2在肥胖及相關(guān)疾病的報道非常少，其調(diào)控機制尚不明確。

本課題組在其他研究過程中發(fā)現(xiàn)AIM2敲除小鼠比野生型小鼠易發(fā)胖，因此開展了本項研究。本研究發(fā)現(xiàn)AIM2 在肥胖小鼠中顯著下調(diào)表達，因此分別對WT小鼠和AIM2敲除小鼠進行高脂造模，結(jié)果顯示AIM2 敲除小鼠的體重增加水平顯著高于WT 小鼠，并且小鼠的脂肪含量更多、脂肪細胞更大。這些結(jié)果表明AIM2在脂肪發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用。接下來對小鼠進行了葡萄糖耐受實驗和胰島素抵抗實驗，結(jié)果顯示AIM2 敲除小鼠的葡萄糖耐受能力顯著低于WT小鼠，并且AIM2敲除小鼠產(chǎn)生了很強的胰島素抵抗。

多項研究已經(jīng)證實脂肪組織巨噬細胞在調(diào)控胰島素抵抗介導的脂肪發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，本研究分別對AIM2fl/flCx3cr1-Cre 和AIM2fl/fl小鼠進行高脂造模，發(fā)現(xiàn)與AIM2敲除小鼠一致，在巨噬細胞中特異性地敲除AIM2 后，小鼠體重增加值顯著高于對照小鼠，脂肪細胞更大，并且葡萄糖耐受能力也顯著低于對照小鼠，胰島素抵抗能力明顯減弱。這些結(jié)果表明AIM2主要在巨噬細胞中發(fā)揮調(diào)控脂肪發(fā)生的作用。

大量研究表明，炎癥小體激活產(chǎn)生的IL-1β和IL-18具有廣泛的生物學功能，在免疫炎癥中起著重要作用。IL-1β可以促進中性粒細胞和巨噬細胞遷移至感染和損傷部位，并且IL-1β也可促進樹突細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的活化［19］。另外，多項研究證實脂肪巨噬細胞極化在調(diào)控脂肪的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。體內(nèi)外炎性因子檢測結(jié)果證實AIM2 敲除小鼠明顯促進M1 型促炎細胞因子IL-6、TNF-α、iNOS 上調(diào)，但是不會顯著影響M2 型抑炎因子Arg1、Ym1、Mrc1 的變化。以上結(jié)果提示AIM2可能通過調(diào)控脂肪組織巨噬細胞向M1型極化來介導胰島素抵抗和脂肪形成。

綜上所述，本研究揭示了炎癥小體AIM2 在肥胖發(fā)生過程中的重要角色，明確了AIM2 主要在脂肪組織的巨噬細胞中發(fā)揮調(diào)控作用，并且是通過抑制巨噬細胞向M1 極化來抑制機體炎癥，進而抑制胰島素抵抗以及脂肪形成。這將為肥胖的治療及其作用機制研究提供一定的理論基礎。