周陽春，章 靜，朱 峰

南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院普外科，江蘇 南京 211166

結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是我國最常見惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年上升，居全部腫瘤第3位，死亡率列第4位，嚴重威脅我國人民生命健康［1］。目前CRC治療方法主要包括根治性手術治療、化學藥物治療以及分子靶向治療等［2］，而腫瘤細胞對化療不敏感常導致CRC治療失敗，嚴重影響患者預后［3］。因此，深入研究CRC化療耐藥機制，降低CRC對化療藥物的耐藥性，對提高CRC患者的預后具有十分重要的意義。

缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的主要特征，且是腫瘤預后的獨立危險因素［4］。缺氧可導致腫瘤細胞生物學行為變化，諸如細胞存活、代謝重組、血管生成、基因組穩(wěn)定性的改變［5-7］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)缺氧參與腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生，然而其機制仍不清楚［8-10］。

水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）是水通道蛋白家族成員之一，具有介導滲透壓依賴性跨生物膜水轉(zhuǎn)運的作用，對H2O2、甘油等小分子物質(zhì)亦具有通透性［11-13］。諸多研究發(fā)現(xiàn)AQP3 參與腫瘤化療耐藥［14-16］。文獻研究證實CRC組織AQP3表達顯著上調(diào)，且促進CRC 細胞增殖、遷移［17］，但AQP3 是否參與CRC 化療耐藥尚不清楚。Hoogewijs 等［18］發(fā)現(xiàn)缺氧可上調(diào)纖維肉瘤L929 細胞AQP3 表達；然而缺氧是否可以上調(diào)CRC中AQP3表達尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧可上調(diào)HCT116 和HT29 細胞中AQP3表達，因此推測缺氧可能通過AQP3介導CRC化療耐藥。

1 材料和方法

1.1 材料

人CRC 細胞系HCT116、HT29 細胞（中國科學院上海細胞庫）；5-Fu（Sigma 公司，德國）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；HIF-1α-siRNA、AQP3-siRNA（上海吉凱基因）；AQP3 抗體（Santa Cruz 公司，美國）；HIF-1α抗體、GAPDH 抗體（CST公司，美國）；BCA試劑盒、抗兔或抗鼠二抗、細胞活性CCK-8 檢測試劑盒（杭州碧云天公司）。RPMI1640 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基（Life Technologies公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

HCT116、HT29 細胞加入RPMI1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清，加入100 U/mL 的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。缺氧條件下細胞培養(yǎng)是將細胞置于密封缺氧箱內(nèi)（含有1%O2）。

1.2.2 RNA干擾實驗

取對數(shù)生長2×105個細胞接種于6 孔板，加入2 mL無抗生素的培養(yǎng)基，混勻，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 d 后進行干擾實驗。20 μmol/L siRNA 10 μL加至250 μL不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5 min。5 μL 的Lipofectamine 2000 加至250 μL 不含血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5 min。再將兩種懸液輕輕混合，室溫孵育20 min。將上述混合液加入到1.5 mL無抗生素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞24 h后，棄去上層液體，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～96 h。

1.2.3 實時熒光定量PCR實驗

采用TRIzol試劑提取細胞RNA，利用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA，實時熒光定量PCR 檢測AQP3 mRNA 表達水平變化。相關引物序列：AQP3上游引物5′-CCGTGACCTTTGCCATGTG-3′，下游引物5′-CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA-3′；HIF-1α上游引物5′-TAGCCGAGGAAGAACTATGAAC-3′，下游引物5′-CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTA-3′；GAPDH 上游引物5′ -CGCTGAGTA CGTCGTGGAGTC-3′，下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。每組實驗重復3 遍。PCR 擴增條件：95 ℃30 s 預變性，95 ℃6 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。在AB17300 系統(tǒng)中檢測目的基因和相應內(nèi)參的Ct值，每組實驗重復3遍。

1.2.4 Western blot實驗

BCA 法測定細胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)用SDS-PAGE 法分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加單克隆抗體于4 ℃下過夜孵育，TBST 洗去一抗，加二抗于室溫孵育2 h，TBST洗去二抗，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫印跡條帶，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5 細胞活力實驗

CCK-8檢測細胞活力。96孔板每孔加入1×104個細胞，37 ℃溫箱培養(yǎng)，24 h 后加入0、20、40、60、80、100 μg/mL 5-Fu 作用24 h，每組均設置3 個平行樣。每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，再用酶標儀檢測，檢測波長450 nm。

1.2.6 平板克隆形成實驗

平板克隆形成實驗評價細胞集落形成能力，將1 000 個細胞種植于6 孔板中，培養(yǎng)14 d 后，用甲醛固定結(jié)晶紫染色后計數(shù)進行評價。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。兩組獨立數(shù)據(jù)采用t檢驗分析組間差異；多組數(shù)據(jù)（同一研究對象在不同時間點的測量數(shù)據(jù)）采用重復測量方差分析總體差異，LSD-t法進行組間兩兩比較；多組數(shù)據(jù)（同一研究對象在不同因素處理的測量數(shù)據(jù)）采用單因素方差分析總體差異，LSD-t法進行組間兩兩比較；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧條件下結(jié)直腸癌細胞AQP3表達上調(diào)

為研究缺氧條件下AQP3在CRC細胞中表達的變化，將HCT116、HT29細胞分別放置于缺氧環(huán)境中（1%O2），結(jié)果提示AQP3 mRNA 表達水平增加（圖1A、B，P＜0.05），AQP3 蛋白表達水平亦顯著增加（圖1C、D）。因此，缺氧條件下，CRC 細胞通過轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)AQP3 mRNA表達，繼而導致AQP3蛋白表達水平增加。

2.2 缺氧通過HIF-1α上調(diào)結(jié)直腸癌細胞AQP3表達HIF-1α是介導細胞對缺氧反應的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)

圖1 缺氧條件下結(jié)直腸癌細胞AQP3表達上調(diào)Figure 1 AQP3 expression in colorectal carcinoma cells was significantly up-regulated under hypoxic condition

節(jié)因子。HCT116 細胞在缺氧12 h、24 h 后，HIF1α蛋白表達水平顯著上調(diào)（圖2A）。采用siRNA 抑制HIF-1α表達后，再將HCT116細胞置于缺氧條件下，AQP3 mRNA、蛋白表達水平均未顯著增加（圖2B、C，P＜0.05）。因此，缺氧通過HIF-1α上調(diào)CRC細胞AQP3 mRNA的表達，繼而導致AQP3蛋白表達水平增加。

2.3 缺氧條件下抑制AQP3表達增加了結(jié)直腸癌細胞對5-Fu的化療敏感性

CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，HCT116細胞在5-Fu 作用下，缺氧條件下的細胞活力高于常氧條件（圖3A，P＜0.05），提示缺氧導致CRC 細胞對5-Fu 的化療敏感性下降。然而，AQP3 在缺氧介導CRC 細胞化療耐藥中的作用尚不清楚。本研究采用siRNA技術抑制AQP3 表達，繼而發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，HCT116 細胞對5-Fu 化療敏感性增加（圖3B，P＜0.05）。平板克隆形成實驗進一步證實了缺氧可導致結(jié)直腸癌細胞對5-Fu 化療敏感性的降低，抑制AQP3 表達可逆轉(zhuǎn)此效應（圖3C、D，P＜0.05）。因此，本研究認為AQP3參與缺氧介導的CRC化療耐藥。

3 討論

圖2 缺氧通過HIF-1α上調(diào)結(jié)直腸癌細胞中AQP3表達Figure 2 Hypoxia upregulated AQP3 expression by HIF-1α in colorectal carcinoma cells

圖3 缺氧條件下抑制AQP3表達增加了結(jié)直腸癌細胞對5-Fu的化療敏感性Figure 3 The sensitivity of colorectal carcinoma cells to 5-Fu was enhenced by inhibiting AQP3 expression under hypoxic condition

缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的主要特征，且參與腫瘤細胞生物學行為變化以及腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生［5-6，8］。HIF-1α是介導細胞對缺氧反應的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)CRC 中HIF-1α高表達，且與腫瘤分化程度、臨床病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關［19］。HIF-1α參與多種腫瘤相關基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。主要包括：①血管新生相關基因：血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等；②糖代謝相關基因：糖酵解酶Ⅱ等；③侵襲、轉(zhuǎn)移相關基因：趨化因子受體4等；④凋亡相關基因：p53等；⑤細胞增殖與分化相關基因：胰島素樣生長因子2、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維生長因子等［20-21］。

AQP3 是水通道蛋白家族成員之一，主要介導水、甘油、H2O2等小分子的跨膜轉(zhuǎn)運［22］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)AQP3參與腫瘤的發(fā)生與進展，促進腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，參與腫瘤化療耐藥［23-24］。這些研究表明AQP3可能在肝癌、乳腺癌的致癌機制及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究也發(fā)現(xiàn)CRC 組織中AQP3表達顯著上調(diào)，且促進CRC 細胞增殖、遷移［17］，但在CRC化療耐藥中的作用尚不清楚。

Hoogewijs 等［18］發(fā)現(xiàn)缺氧可上調(diào)纖維肉瘤L929細胞AQP3 表達；然而缺氧是否可以上調(diào)CRC 的AQP3表達尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧促進CRC細胞株HCT116、HT29 細胞中AQP3 mRNA、蛋白表達上調(diào)，抑制HIF-1α表達后AQP3表達明顯下調(diào)，提示缺氧通過HIF-1α調(diào)控AQP3表達。HIF-1α是細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，研究提示AQP3 啟動子區(qū)域存在HIF-1α 反應元件（HIF-1 response element，HRE）［18］，然而CRC細胞AQP3啟動子區(qū)域是否存在HRE，需要進一步研究。同時，缺氧可導致腫瘤細胞產(chǎn)生應激反應，繼而導致細胞內(nèi)H2O2積聚，而AQP3 可轉(zhuǎn)運H2O2，因此缺氧可能導致腫瘤細胞AQP3表達上調(diào)，繼而加劇腫瘤細胞處于缺氧環(huán)境。

諸多研究表明缺氧可降低實體腫瘤化療的敏感性，繼而導致腫瘤細胞化療耐藥。然而AQP3 是否參與缺氧介導的CRC 細胞化療耐藥尚不清楚。本研究進一步證實缺氧降低CRC 細胞對氟尿嘧啶的化療敏感性，通過siRNA 技術下調(diào)HCT116 細胞中AQP3 表達后，缺氧導致的化療耐藥得以逆轉(zhuǎn)。因此，以上研究表明AQP3 參與缺氧介導CRC 化療耐藥，有利于進一步深入了解CRC化療耐藥的機制以及AQP3介導腫瘤化療耐藥的機制。